JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
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Tome dos microplacas que contengan cubreobjetos con macrófagos derivados de la médula ósea o BMM.
Agregue promastigotes metacíclicos de Leishmania, la etapa flagelada alargada, en una placa y amastigotes, la etapa ovalada no flagelada, en otra placa.
Durante la incubación, los parásitos se unen a los receptores de macrófagos, desencadenando la fagocitosis mediada por receptores.
El fagosoma se fusiona con los lisosomas y vesículas derivados del retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, madurando en una vacuola parasitófora.
La disminución del pH de la vacuola desencadena la diferenciación del promastigote en amastigote y su replicación.
Lavar para eliminar los parásitos no internalizados.
Fije los macrófagos infectados y agregue detergente para permeabilizar las células y los parásitos.
Introducir un colorante de ácido nucleico fluorescente para teñir los núcleos de macrófagos y parásitos.
Monte los cubreobjetos en portaobjetos y observe bajo un microscopio de fluorescencia, cuantificando los núcleos del huésped más grandes y los núcleos de amastigote más pequeños circundantes.
Compare los números de amastigotes para evaluar su multiplicación dentro de los macrófagos inicialmente infectados con promastigotes indiferenciados versus aquellos infectados con amastigotes replicativos.
Para infectar las células con L. amazonensis, diluya la suspensión del parásito a la multiplicidad experimental apropiada de infección y agregue de 50 a 100 microlitros de parásitos a cada pocillo de todas las placas de 6 pocillos, incluidos todos los puntos de tiempo del experimento. Incubar los macrófagos derivados de la médula ósea durante el período de infección y la temperatura adecuados. Luego, lave los pocillos tres veces con 2 mililitros de PBS fresco a 37 grados Celsius sin calcio ni magnesio por pocillo, y fije las muestras de punto de tiempo inicial con 1,5 a 2 mililitros de paraformaldehído al 2% durante 10 minutos.
Para las placas correspondientes a los puntos de tiempo posteriores, agregue 2 mililitros de medio macrófago fresco derivado de médula ósea a cada pocillo y devuelva las placas a la incubadora adecuada. Luego, fije y lave las células para cada punto de tiempo restante como se acaba de demostrar, y almacene las muestras a 4 grados Celsius en PBS fresco.
Para teñir las células con DAPI, reemplace el sobrenadante con 1,5 mililitros de PBS fresco sin calcio ni magnesio, complementado con detergente no iónico al 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de 2 mililitros con PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, tiña las células con 2 microgramos por mililitro de DAPI en 1 mililitro de PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
Después de tres lavados, coloque los cubreobjetos con la celda hacia abajo en portaobjetos de microscopio de vidrio individuales montados con un reactivo de montaje antidecoloración disponible en el mercado. Luego, para cuantificar el número de células infectadas, use el objetivo de aceite de inmersión 100x de un microscopio de fluorescencia y un contador Emanuel, para identificar el número de núcleos de amastigote más pequeños agrupados alrededor de cada núcleo de macrófago grande teñido con DAPI.