Un ensayo de liberación de colorante para cuantificar la actividad enzimática de las proteínas antimicrobianas

Comience con un tubo que contenga una suspensión bacteriana muerta por calor y trátelo con una solución de tinte.

Las moléculas de tinte se unen covalentemente al peptidoglicano, un componente esencial de la pared celular bacteriana, que imparte una coloración azul.

Granular las bacterias y eliminar el sobrenadante que contiene moléculas de tinte no unidas.

Vuelva a suspender las bacterias e introduzca una solución de proteína antimicrobiana en el tubo, lo que desencadena la hidrólisis enzimática del peptidoglicano bacteriano, lo que resulta en la degradación de la pared celular seguida de lisis celular.

Esto conduce a la liberación de las moléculas de colorante, impartiendo coloración azul.

Agregue etanol, un agente desnaturalizante de proteínas, que inactiva las proteínas antimicrobianas y termina la reacción enzimática.

Centrifugar el contenido para granular los fragmentos celulares y las enzimas. Transfiera el sobrenadante que contiene la molécula de tinte a una placa de pocillos múltiples.

Usando un lector de placas, mida la absorbancia a 595 nanómetros.

Compare la absorbancia de la muestra tratada con enzimas con la de la muestra no tratada con enzimas para cuantificar la actividad enzimática de la proteína antimicrobiana.

En el ensayo de liberación de colorante, el sustrato se une covalentemente al colorante Remazol Brilliant Blue R o RBB. Comience este protocolo haciendo una solución RBB de 200 milimolares. Disuelva 1,25 gramos de RBB en una solución de hidróxido de sodio recién preparada.

A continuación, vuelva a suspender las células bacterianas muertas por calor a una concentración de 0,5 gramos de peso húmedo en 30 mililitros de solución RBB. Para el peptidoglicano purificado, vuelva a suspender el peptidoglicano a una concentración de 0,3 gramos de peso húmedo y 30 mililitros de solución RBB.

Dado que los pasos posteriores son los mismos independientemente del sustrato utilizado, el etiquetado se demostrará solo para las células bacterianas. Incube la mezcla de reacción en una plataforma giratoria durante seis horas a 37 grados centígrados con una mezcla suave. Después de seis horas, transfiera la mezcla de reacción a una incubadora de 4 grados Celsius e incube durante 12 horas adicionales con una mezcla suave.

Cuando se complete la incubación, coseche el sustrato teñido por centrifugación a 3.000 veces g durante 30 minutos. Decantar la solución de tinte del pellet de sustrato. Vuelva a suspender el pellet completamente en agua tipo 1 seguido de centrifugación. Lave las células marcadas con tinte de tres a cinco veces de esta manera para eliminar el tinte soluble unido no covalentemente de los sustratos.

Para los lavados finales, transfiera la porción de gránulos que se utilizará en el ensayo de liberación de tinte a tubos de microfuga de 1,5 mililitros. El sobrenadante del último lavado debe ser claro, mientras que el sustrato permanece azul. Almacene el sustrato teñido suspendido en una cantidad mínima de agua a 20 grados centígrados negativos hasta que esté listo para su uso.

Para prepararse para el ensayo de liberación de colorante, deje que el sustrato teñido congelado vuelva a la temperatura ambiente y lávelo dos veces con el tampón de ensayo que se determinó empíricamente para la enzima. PBS, en este caso. Calcule el volumen de la suspensión de sustrato que se necesita multiplicando el volumen de reacción de 200 microlitros por el número de ensayos de liberación de colorante que se realizarán.

Para preparar la suspensión del sustrato, primero agregue el sustrato teñido al volumen apropiado de PBS. Haga una dilución uno a uno y tome una medición inicial de la densidad óptica a 595 nanómetros usando PBS como un espacio en blanco. Agregue cantidades incrementales del sustrato teñido a la suspensión hasta lograr una densidad óptica de 2.0 a 595 nanómetros.

En esta demostración, el ensayo de liberación de colorante se utilizará para determinar las condiciones óptimas de incubación para una proteína antimicrobiana. Primero, prepare una suspensión antimicrobiana de proteína madre ajustando la concentración a 1 miligramo por mililitro usando PBS, como se describe en el texto del protocolo. Luego, diluya la suspensión antimicrobiana de proteína madre a una concentración de 100 nanogramos por microlitro.

Esta concentración da una masa de reacción final de 1 microgramo de proteína por volumen agregado a la reacción del ensayo. Realice los ensayos de reacción en tubos de microfuga de 0,5 mililitros para el rango térmico a evaluar. Para cada condición térmica, agregue 10 microlitros de la proteína madre a 200 microlitros de suspensión de sustrato preparada.

Incubar en un termociclador durante ocho horas con mezcla por inversión una vez por hora. Después de la incubación, detenga las reacciones agregando 25 microlitros de etanol a cada tubo de microfuga. Para eliminar el sustrato insoluble no digerido, centrifugar a 3.000 veces g durante dos minutos. Después de eso, teniendo cuidado de no interrumpir el gránulo de sustrato no digerido, transfiera 150 microlitros del sobrenadante de reacción para cada mezcla de reacción a una microplaca de fondo plano de 96 pocillos.

Para cuantificar la actividad enzimática, use un espectrofotómetro de microplacas para medir la absorbancia del sobrenadante a 595 nanómetros. El aumento de la absorbancia por el colorante soluble liberado en el sobrenadante desde el sustrato marcado es una medida cuantitativa de la actividad enzimática.