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Inmunología
0 vistas • 5:10 min • July 8th, 2025
Trate las cepas bacterianas que no producen piomelanina y no piomelanina con un agente de prueba.
La piomelanina, un pigmento extracelular, proporciona protección contra el estrés oxidativo.
El agente de prueba interrumpe la biosíntesis de piomelanina, reduciendo su producción.
Después de la incubación, realice diluciones bacterianas en serie con un tampón que contenga el agente de prueba o el disolvente del vehículo.
Detecte diluciones bacterianas en placas de agar con concentraciones variables de peróxido de hidrógeno, un factor de estrés oxidativo.
Las placas que carecen de peróxido de hidrógeno sirven como controles.
incubar. En las placas de control, las bacterias forman colonias.
En la cepa productora de piomelanina no tratada, la piomelanina protege a las bacterias del daño oxidativo inducido por el peróxido de hidrógeno, lo que da como resultado colonias pigmentadas.
Sin embargo, la cepa productora de piomelanina tratada con el agente de prueba, que exhibe piomelanina reducida, se vuelve sensible al estrés oxidativo, lo que resulta en la muerte bacteriana.
Contar colonias.
El recuento y el tamaño reducidos de las colonias con el aumento de las concentraciones de peróxido de hidrógeno en las cepas tratadas productoras de piomelanina y tratadas y no tratadas que no producen piomelanina que los controles indican una mayor sensibilidad bacteriana al estrés oxidativo.
Para comenzar este procedimiento, configure cultivos nocturnos de las cepas que se analizarán en LB, con y sin NTBC. Al día siguiente, prepare placas de agar LB que contengan peróxido de hidrógeno como factor de estrés oxidativo. Primero, derrita los matraces de agar LB y enfríe el medio a aproximadamente 50 grados centígrados a temperatura ambiente.
A continuación, agregue peróxido de hidrógeno directamente al medio enfriado en las concentraciones deseadas. Agite el matraz para mezclar. Un rango de concentraciones de peróxido de hidrógeno de 0 a 1 milimolar es un buen punto de partida. Vierta los platos inmediatamente y flamee la superficie para eliminar las burbujas. El rendimiento es de cuatro placas por 100 milímetros de agar LB. Marque las placas con la concentración de peróxido de hidrógeno.
Coloque las placas destapadas en una campana de flujo biológico, con un ventilador funcionando durante 30 minutos para eliminar el exceso de humedad de las placas. Los platos deben usarse el mismo día en que se preparan. Mientras se secan las placas, lave y mida el OD600 de los cultivos nocturnos.
Normalice el OD600 de todos los cultivos nocturnos al valor más bajo para el conjunto de cepas que se están probando. Para hacer esto, determine el volumen de cultivo necesario para diluir el cultivo al OD600 más bajo en un volumen total de 1 mililitro.
Por ejemplo, si un cultivo tiene un OD600 de 3 y el OD600 más bajo para el conjunto de cepas es 2,5, realice el siguiente cálculo, que dará como resultado 0,833 mililitros como volumen de cultivo necesario. Colocar 0,833 mililitros de cultivo en un tubo de microfuga. A continuación, calcule la cantidad de LB más NTBC o LB más DMSO necesaria para llevar el volumen de cultivo a 1 mililitro. En este ejemplo, la cantidad sería de 0,167 mililitros. Mezclar por vórtice.
Para mantener los cultivos en una concentración constante de NTBC o DMSO, realice diluciones seriadas de 10 veces de los cultivos normalizados durante la noche en PBS más NTBC o PBS más DMSO. Haga que las soluciones madre de PBS más NTBC y PBS más DMSO aumenten o disminuyan, según la cantidad de cepas que se prueben.
Para un conjunto de diluciones para una cepa, mezcle 300 micromolares de NTBC o un volumen equivalente de DMSO con PBS para obtener un volumen total de 720 microlitros. Agregue 90 microlitros de PBS más NTBC o PBS más DMSO a los tubos de microfuga apropiados etiquetados para 10 a menos 1 a 10 a menos 7 diluciones en serie. Agregue 10 microlitros de cultivo a los 10 apropiados al tubo de dilución menos 1.
Mezclar por vórtice y transferir 10 microlitros de la dilución 10 a menos 1 al 10 al tubo de dilución menos 2. Cambiando las puntas de la pipeta entre diluciones, repita hasta que se hayan realizado todas las diluciones.
Detecte 5 microlitros de las diluciones de 10 a menos 3 a 10 a menos 7 en LB más placas de peróxido de hidrógeno por duplicado para cada cepa. Utilice una punta de pipeta si las manchas están chapadas para diluir más o menos diluir. No incline ni incline el plato hasta que el líquido se haya secado en el plato. Incube las placas a 37 grados centígrados. Durante 24 a 48 horas, dependiendo de la cepa. Una vez que hayan aparecido colonias de buen tamaño, fotografíe las placas con una cámara CCD sobre un transiluminador.