Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:20 min. • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga diluciones en serie del compuesto de prueba, un antibiótico aminoglucósido.
Agregue una suspensión de Mycobacterium tuberculosis, una bacteria patógena, en los pozos e incube.
En el citoplasma, el compuesto de prueba se une a la subunidad ribosómica micobacteriana 30S, inhibiendo la síntesis normal de proteínas y, finalmente, provocando la muerte de las micobacterias.
Después de la incubación, agregue resazurina, un tinte soluble en agua débilmente fluorescente, a los cultivos. Incubar.
Dentro de las micobacterias metabólicamente activas viables, las enzimas deshidrogenasas reducen la resazurina de color azul a una resorufina fluorescente de color rosa.
Con un lector de placas de fluorescencia, mida la intensidad de la fluorescencia de la resorofina en los pocillos.
Un valor de baja intensidad de fluorescencia con concentraciones crecientes de compuestos de prueba sugiere sus efectos citotóxicos contra las micobacterias.
Para realizar un ensayo de resazurina, cultivar M. tuberculosis en la fase 7H9ADST hasta la fase logarítmica media. Diluir el cultivo con 7H9ADST a un DE600 de 0,01. Use 7H9ADST para diluir los compuestos al doble de las concentraciones de prueba y alícuota 100 microlitros de cada compuesto diluido en cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos.
Transfiera 100 microlitros de la suspensión bacteriana diluida a cada pocillo. Incube las placas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada durante 5 días. Disuelva 10 miligramos de resazurina en 100 mililitros de agua desionizada y esterilice la solución con filtro. Agregue 30 microlitros de solución de resazurina a los pocillos. Luego, incube las células durante 48 horas.
El crecimiento bacteriano se indica mediante una conversión de color de azul a rosa. Realizar análisis cuantitativos según el protocolo de texto.