Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 6:41 min. • July 8th, 2025
Tome una placa de microtitulación con tapa con soportes cilíndricos, o clavijas, recubiertas de biopelículas bacterianas.
Coloque la tapa de clavija recubierta de biofilm en los pocillos de la placa de microtitulación con tampón para eliminar las bacterias planctónicas o sueltas, centrándose en las mediciones adheridas a biofilm.
Transfiera la tapa de clavija recubierta de biopelícula enjuagada a una placa de desafío con concentraciones crecientes de agentes antibacterianos de prueba. Incubar sin agitar.
Dependiendo de la concentración del agente y el potencial antibacteriano, interrumpe la actividad metabólica bacteriana y la integridad de la biopelícula.
Después de la incubación, coloque la tapa de la clavija en los pocillos de placas que contienen tampón para eliminar las bacterias planctónicas.
Transfiéralo a pocillos de placa de microtitulación con un medio de recuperación de biopelícula que contenga resazurina, un tinte débilmente fluorescente y permeable a las células. Incubar.
En bacterias metabólicamente activas, las enzimas deshidrogenasas reducen la resazurina de color azul a resorufina fluorescente de color rosa.
La falta de conversión de resazurina indica la erradicación de la biopelícula, mientras que la conversión a resorufina sugiere la presencia de células viables.
La concentración más baja de agente antibacteriano de prueba que no produce conversión de resazurina denota la concentración mínima de erradicación de biopelícula.
Tome una placa nueva de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de CRPMI equilibrados a temperatura ambiente a cada pocillo de las filas B a H. Diluya hasta cuatro compuestos de prueba por separado en 1,0 mililitro de CRPMI a 2 veces la concentración final deseada. Agregue 200 microlitros de compuesto uno en los pozos A1 a A3, 200 microlitros de compuesto dos en los pozos A4 a A6, 200 microlitros de compuesto tres en los pozos A7 a A9 y 200 microlitros de compuesto cuatro en los pozos A10 a A12.
Diluir en serie los compuestos de prueba con una pipeta multicanal. Comience transfiriendo 100 microlitros de la fila A a la fila B y mezcle. De esa manera, continúe transfiriendo 100 microlitros de pozo a pozo. Mezcle después de cada transferencia y deténgase en la fila F. Después de mezclar, expulse 100 microlitros de la fila F a un contenedor de residuos. No transfiera ningún líquido a las filas G y H. Finalmente, agregue 100 microlitros de CRPMI a cada pocillo de la placa utilizando una pipeta multicanal, para llevar el volumen final a 200 microlitros.
Agregue 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato a una placa estéril fresca de 96 pocillos que tenga pocillos con dimensiones idénticas a las de la placa de inicio de biopelícula. A continuación, retire la bolsa de plástico y la película de parafina de la placa de iniciación de la biopelícula incubada. Levante la tapa hacia arriba, evitando el contacto entre las clavijas y el fondo de la placa, ya que esto puede dañar la biopelícula. Conserve la parte inferior para el análisis posterior de OD600.
Enjuague las células planctónicas colocando la tapa de la clavija en la placa que contiene PBS. Sumerja las clavijas durante 5 segundos, sáquelas del PBS y sumérjalas una vez más, teniendo cuidado de no golpear las clavijas contra los lados del pozo. Coloque la tapa de clavija enjuagada en la placa de desafío. Evite el contacto innecesario entre las clavijas y la placa inferior, ya que esto dañará la biopelícula y dará lugar a resultados inconsistentes.
Selle la placa con una película de parafina y colóquela en una bolsa de plástico con cierre como antes. Incube la placa sin agitar durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Tome la parte inferior de la placa de inicio de la biopelícula y vuelva a suspender las bacterias en cada pocillo con una pipeta multicanal. Mida el OD600 con un lector de microplacas adecuado para confirmar el crecimiento que ocurre en todos los pocillos, pero los controles de esterilidad en la fila H.
Utilice un lector de placas equipado con una cámara de incubación y capaz de tomar lecturas de fluorescencia cinética para detectar la conversión de resazurina. Configure una medición de fluorescencia cinética de 24 horas utilizando una excitación de 530 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros. Ajuste la temperatura de la cámara a 37 grados centígrados y lea la placa cada 20 minutos.
Configure el lector de placas para medir desde la parte inferior de la placa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Prepárese para lavar la placa agregando 200 microlitros de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos con una pipeta multicanal. Luego, prepare el medio de recuperación de biofilm agregando 400 microlitros de 0,8 miligramos por mililitro de solución madre de resazurina a 20 mililitros de medio CRPMI, hasta una concentración final de 16 microgramos por mililitro de resazurina.
A continuación, agregue 150 microlitros de medio de recuperación de biopelícula con una pipeta multicanal, a cada pocillo de una placa fresca de 96 pocillos. Transfiera la placa de desafío de la incubadora a un gabinete de bioseguridad y retire con cuidado la bolsa de plástico y la película de sellado. Retire la tapa de la clavija de la placa de desafío y enjuague las células planctónicas en PBS como antes, manteniendo la parte inferior de la placa de desafío para el análisis posterior de OD600.
Después de enjuagar, coloque la tapa de clavija en el fondo de la placa que contiene el medio de recuperación de biopelícula. Envuelva el costado de la placa con una película de parafina, teniendo cuidado de no obstruir el fondo de los pozos perimetrales. Inmediatamente después de envolver la placa, colóquela en el lector de placas e inicie una lectura cinética durante un período de 24 horas iniciando el protocolo cinético de resazurina previamente realizado.