JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:34 min • July 8th, 2025
Tome una microplaca que contenga células de mamíferos en hielo.
Agregue un medio que contenga calcio a los pozos seleccionados y un medio sin calcio a los demás.
Introducir monómeros de una toxina bacteriana formadora de poros. Una temperatura baja evita la agregación de monómeros, facilitando la unión al colesterol de la membrana celular.
Incubar a una temperatura fisiológica, permitiendo que los monómeros unidos al colesterol se oligomericen y se inserten en la membrana, formando un poro.
En pozos con calcio extracelular, el poro causa la entrada de calcio.
La afluencia desencadena el desprendimiento exosomal de la toxina y el resellado de la membrana.
El aumento de calcio intracelular también induce la exocitosis lisosomal, liberando una enzima que convierte la esfingomielina de la membrana en ceramida.
La membrana enriquecida con ceramidas desencadena la endocitosis de toxinas, volviendo a sellar la membrana.
El resellado de la membrana se ve obstaculizado en pocillos sin calcio extracelular.
Agregue yoduro de propidio o PI, un tinte fluorescente, que no puede ingresar a las células con una membrana reparada, pero ingresa a las células dañadas para unirse al ADN, emitiendo fluorescencia.
Mida la fluorescencia a intervalos definidos para evaluar la eficiencia del resellado de la membrana.
Para configurar un ensayo basado en fluorescencia de alto rendimiento para las condiciones permisivas de reparación, lave las células dos veces con 200 microlitros de medio 37 grados Celsius M1 por pocillo y agregue 100 microlitros de medio fresco 37 grados Celsius M1 complementado con yoduro de propidio 30 micromolares después de desechar el segundo lavado.
Para condiciones restrictivas de reparación, lave las células una vez con 200 microlitros de medio M2 a 37 grados Celsius suplementado con EGTA de 5 milimolares por pocillo, seguido de un lavado con 200 microlitros de medio M2 solo.
Después de desechar el segundo lavado, agregue 100 microlitros de medio fresco de 37 grados Celsius M2 complementado con yoduro de propidio de 30 micromolares por pocillo. Luego, obtenga una imagen de la placa bajo luz transmitida, GFP y PI, como se acaba de demostrar. Mientras se toman imágenes de la placa, coloque una microplaca de polipropileno de fondo redondo de 96 pocillos sobre hielo y configure la placa como se acaba de demostrar para la placa anterior.
Para condiciones permisivas de reparación, agregue 100 microlitros de medio M1 helado suplementado con 60 yoduro de propidio micromolar por pocillo, seguido de la adición de 100 microlitros de M1 helado con o sin 4x listeriolisina O por pocillo.
Para condiciones restrictivas de reparación, agregue 100 microlitros de medio M2 helado suplementado con 60 yoduro de propidio micromolar por pocillo, seguido de la adición de 100 microlitros de M2 helado con o sin 4x listeriolisina O por pocillo.
Es imperativo preparar la listeriolisina O a la concentración experimental adecuada en hielo aproximadamente 5 minutos antes del inicio del ensayo cinético cuando la placa 1 está en hielo y la placa 2 se está preparando.
Cuando termine de obtener imágenes de la primera placa, transfiérala inmediatamente a una hoja de papel de aluminio sobre hielo. Después de 5 minutos, transfiera 100 microlitros de cada pocillo de la segunda placa al pocillo correspondiente apropiado en la primera placa enfriada, insertando las puntas de la pipeta debajo del menisco de la solución en cada pocillo antes de expulsar el volumen sin mezclar para una distribución adecuada de la toxina.
Deje que la toxina se una a las células huésped durante 1 minuto y transfiera inmediatamente la primera placa al lector de placas para el ensayo postcinético utilizando el modo de espectrofluorómetro. Al final del ensayo cinético, adquiera inmediatamente una imagen postcinética de la imagen de la placa como se demuestra para la imagen precinética.