Tinción inmunohistoquímica para la detección de antígenos del virus de la rabia

Comience con una diapositiva que lleve una sección de tejido cerebral de ratón infectado con el virus de la rabia fijado en formalina e incluida en parafina. La sección fija retiene los antígenos virales a través de la reticulación de proteínas.

Trate el portaobjetos con una solución de xileno para eliminar la parafina.

Sumerja el portaobjetos en concentraciones decrecientes de etanol para rehidratar el tejido, haciéndolo compatible con soluciones acuosas.

Introducir un tampón que contenga proteasa para interrumpir los enlaces cruzados de proteínas, mejorando la accesibilidad al antígeno.

Sumérjase en peróxido de hidrógeno para bloquear las peroxidasas endógenas y aplique una solución de bloqueo para evitar interacciones no específicas.

Introducir anticuerpos primarios específicos para el antígeno de la rabia, formando complejos antígeno-anticuerpo.

Agregue anticuerpos secundarios biotinilados, que se unen a los anticuerpos primarios. Incubar con enzimas peroxidasas conjugadas con estreptavidina, que interactúan con la biotina.

Introducir un sustrato de peroxidasa, produciendo un precipitado rojo magenta.

Contratiña el tejido con una tinción nuclear, seguida de un agente azulado, tiñendo los núcleos de azul.

La imagen inmunohistoquímica revela manchas de color rojo magenta en el citoplasma, lo que confirma la presencia de antígenos de la rabia en la sección de tejido.

Con un micrótomo, haga una sección de parafina de 5 micrómetros. Haga flotar la sección en un baño de agua a 38 grados centígrados y recójala en portaobjetos de vidrio. Etiquete los portaobjetos con un bolígrafo resistente a los reactivos. Coloque los portaobjetos en una bandeja y derrita en un horno a 55 a 60 grados centígrados durante una hora.

Luego, retire los portaobjetos del horno e inmediatamente desparafinarlos con tres enjuagues consecutivos de xileno de cinco minutos cada uno. Después de esto, rehidrate las secciones del portaobjetos mediante inmersiones secuenciales en diluciones decrecientes de etanol a agua desionizada, como se describe en el protocolo de texto.

Trate los portaobjetos con la proteasa durante 30 minutos para la recuperación del antígeno proteolítico, luego, enjuague los portaobjetos en PBST durante 10 minutos y trátelos con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos. Después de esto, vuelva a lavar los portaobjetos con PBST durante 10 minutos.

Para comenzar, retire un portaobjetos del tampón, asegurándose de manipular solo un portaobjetos a la vez, mientras los otros permanecen sumergidos, y use una toalla de papel para secar el exceso de tampón alrededor de la sección de tejido. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad e incube con suero de cabra normal a temperatura ambiente durante 15 minutos.

A continuación, incube los portaobjetos en la cámara de humedad con la dilución predeterminada óptima, el anticuerpo primario antirrábico y los anticuerpos de control negativo a temperatura ambiente durante 60 minutos sin lavados intermedios. Después de esto, lave los portaobjetos con PBST durante 10 minutos e incube en una cámara de humedad con el anticuerpo biotinilado a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Vuelva a lavar los portaobjetos con PBST durante 10 minutos. Incube los portaobjetos en una cámara de humedad con el complejo estreptavidina-HRP a temperatura ambiente durante 15 minutos y lave el PBST durante 10 minutos. Luego, incube con AEC en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lave los portaobjetos en agua desionizada durante 10 minutos y contratiña con hematoxilina de Gill diluida 1 a 2 con agua desionizada durante dos minutos.

Después de esto, enjuague el exceso de hematoxilina enjuagando los portaobjetos en agua desionizada. Enjuague los portaobjetos con agua del grifo de Scott durante 30 segundos y lávelos con agua desionizada durante 10 minutos. Retire las diapositivas una a la vez y móntelas con un medio de montaje soluble en agua. Luego, use un microscopio óptico para leer los portaobjetos.