Inmunohistoquímica para estudiar la relación entre los macrófagos y las células inmunitarias infiltradas

0 vistas4:00 min • July 8th, 2025

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Comience con un portaobjetos que contenga secciones de biopsia de arteria temporal fijadas en formalina, desparafinadas y rehidratadas con células inmunitarias infiltradas, incluidos linfocitos y macrófagos.

Los macrófagos activados expresan el receptor de folato beta o FR-β, un marcador relacionado con la enfermedad, que diferencia a los macrófagos de otras células inmunitarias.

Transfiera el portaobjetos a un tampón precalentado para recuperar los receptores de la superficie.

Tratar la sección con peróxido de hidrógeno, bloqueando la actividad de la peroxidasa intracelular.

Introduzca una mezcla de anticuerpos primarios dirigidos a CD3, CD68 y FR-β, que se unen a las células inmunitarias que expresan estas proteínas.

Agregue anticuerpos secundarios biotinilados, interactuando con anticuerpos primarios, y lave.

Recubrimiento con enzimas conjugadas con estreptavidina que se unen a la biotina.

Tratar con un sustrato cromogénico que interactúa con las enzimas, produciendo precipitados marrones localizados.

Introduzca una contratinción: hematoxilina, tiñendo los núcleos de azul.

Identifique microscópicamente las células pequeñas, redondas y teñidas de marrón como linfocitos que expresan CD3 y las células grandes, irregulares y teñidas de marrón como macrófagos que expresan CD68 y FR-β.

Cuantifique los macrófagos en la sección para encontrar su proporción entre el total de células inmunitarias infiltradas.

Para la recuperación de antígenos, transfiera la rejilla a un recipiente de vidrio con 200 microlitros de 95 grados Celsius, 10 milimolares por litro, tampón de citrato durante 30 minutos. Al final de la incubación, deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de enjuagarlos con agua corriente durante cinco minutos.

Para eliminar la actividad de la peroxidasa endógena, primero, use un marcador hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor de cada muestra de tejido, antes de incubar las muestras en 200 microlitros de peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos, seguido de tres lavados en 200 microlitros de solución salina tamponada con Tris o TBSS por lavado. Después del último lavado, frote suavemente cada portaobjetos para eliminar cualquier exceso de tampón y agregue 200 microlitros del cóctel de anticuerpos primarios de interés y un cubreobjetos a cada portaobjetos para una incubación de una hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, deseche los cubreobjetos y enjuague los portaobjetos con tres lavados de dos minutos en TBSS nuevo. Después de eliminar el exceso de tampón, agregue 200 microlitros de una solución de anticuerpo secundario biotinilado adecuada y un cubreobjetos a cada portaobjetos para una incubación de 45 minutos en la cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de desechar los cubreobjetos, enjuague los portaobjetos con TBSS, como se demostró. Elimine cualquier exceso de tampón.

Habilite las secciones con 200 microlitros de tampón de sustrato DAB durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave los portaobjetos con TBSS y agua corriente del grifo durante 10 minutos, antes de contrateñir con hematoxilina durante tres minutos. Luego, agregue 70 microlitros de un medio de montaje apropiado a cada portaobjetos e incline lentamente un cubreobjetos de vidrio sobre el medio de montaje para evitar crear burbujas a medida que el cubreobjetos se coloca en su lugar.

Para el análisis histopatológico, coloque el portaobjetos en el platina de un microscopio óptico y evalúe la arquitectura vascular de la primera sección de tejido. Luego, cuantifique el número de macrófagos en relación con el número de linfocitos por sección.

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Última actualización: 15 agosto 2026