Un ensayo para el análisis del ciclo celular de células T CD8⁺ específicas de antígenos

Tome células de órganos linfoides secundarios de un ratón inmunizado con antígeno, que contienen células T CD8⁺ específicas de antígeno en diferentes etapas del ciclo celular.

G₁, S, G₂ y M son etapas de células que se dividen activamente, mientras que las células en la etapa G₀ están inactivas.

Agregue un colorante de viabilidad fluorescente para marcar las células muertas y los anticuerpos marcados con fluoróforo que se unen a los marcadores de superficie de las células T CD3 y CD8.

Introducir multímeros antigénicos de péptido-MHC conjugados con fluoróforos para unirse a los receptores de células T, marcando las células T específicas de antígeno.

Con un tampón, fije y permeabilice las células.

Introducir anticuerpos marcados con fluoróforo para unirse a una proteína nuclear asociada a la proliferación celular, tiñendo las células que se dividen activamente.

Agregue una tinción fluorescente para etiquetar el ADN.

Mediante citometría de flujo, seleccione las células vivas e identifique las células T CD8⁺ específicas de antígeno a través de las etiquetas unidas a la superficie.

La intensidad de la tinción de ADN discrimina las células G₀ y G₁ con una cantidad de ADN más baja de las células S, G₂ y M con una cantidad de ADN más alta. La ausencia del anticuerpo específico de la proteína nuclear separa las células G₀.

Prepare un tampón de lavado de permeabilización 1X fresco diluyendo el tampón de permeabilización 10X con agua destilada y fíltrelo a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar los agregados. Diluya el anticuerpo monoclonal Ki67-FITC en tampón de lavado de permeabilización 1X según se determine con un experimento de titulación para un volumen final de 100 microlitros por muestra.

Agregue 3 mililitros del tampón de lavado de permeabilización 1X a cada tubo con celdas y centrifugue a 400 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Nuevamente, agregue el tampón de lavado de permeabilización 1X y centrifugue para granular las células, luego, deseche el sobrenadante.

Agregue 100 microlitros de anticuerpo monoclonal diluido Ki67-FITC al gránulo, luego, haga un vórtice e incube durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, lave las células dos veces con 4 mililitros de tampón de permeabilización 1X, centrifugando después de cada lavado, y deseche el sobrenadante.

Agregue 350 microlitros de PBS al sedimento celular para que las muestras se adquieran directamente en el citómetro de flujo, y 250 microlitros de PBS al sedimento celular para las muestras que se incubarán con Hoechst para la tinción de ADN. Prepare la solución de Hoechst y PBS y agréguela a cada muestra, de modo que la concentración final sea de 2 microgramos por mililitro. Agite e incube las muestras durante 15 minutos en la oscuridad. Luego, centrifuga las muestras durante 5 minutos y agrega 350 microlitros de PBS al pellet celular.

Abra el software y cree diferentes grupos correspondientes a los diferentes órganos a analizar haciendo clic en Crear grupo en la sección de la cinta del espacio de trabajo. Abra la ventana Modificar grupo haciendo doble clic en el nombre del grupo y sincronice los grupos recién creados insertando una marca de verificación en la función Sincronizado.

Arrastre cada archivo FCS a su grupo correspondiente y, a continuación, cree una estrategia de compuerta que comience con un grupo LN directo. Abra la ventana del gráfico haciendo doble clic en la muestra completamente teñida para mostrar los eventos no marcados adquiridos para esta muestra en un diagrama de puntos. Tenga en cuenta que los ejes x e y están etiquetados como en los archivos FCS, como se indica en la Tabla 2 del archivo de configuración del citómetro de flujo de este manuscrito. Compruebe que se muestra un número suficiente de eventos para una visualización adecuada.

Si es necesario, abra Preferencias haciendo clic en el icono del corazón en la cinta del espacio de trabajo, seleccione Gráficos, luego Diagrama de puntos como Tipo de gráfico y verifique que el número de puntos dibujados en el cuadro correspondiente sea correcto o cámbielo. Muestre los eventos no activados en la ventana del gráfico en un diagrama de puntos con DNA-A en el eje x y DNA-W en el eje y. Utilice una escala lineal para ambos ejes. Si es necesario, cambie la escala de logarítmica a lineal haciendo clic en el cuadro indicado con una T cerca de cada eje en la ventana del gráfico.

Seleccione una población de una sola celda haciendo clic en Rectángulo en la sección Herramientas de compuerta, luego haga doble clic en el centro de la puerta rectangular para mostrar celdas individuales en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje x y el tinte de células muertas en el eje y.

Haga clic en el polígono para seleccionar la población de células vivas, que son negativas para el tinte de células muertas. Haga doble clic en el centro de la puerta del polígono para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje x y el parámetro SSC-A en el eje y.

Haga clic en Rectángulo y cree una puerta "relajada" para incluir todas las células vivas individuales en ese gráfico. Haga doble clic en el centro de la puerta relajada para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con CD3 en el eje x y CD8 en el eje y.

Utilice la escala de eje adecuada para la visualización en la ventana del gráfico. Si es necesario, modifique la escala x e y haciendo clic en el cuadro indicado con una T cerca de cada eje. Elija Personalizar función de eje y modifique las décadas negativas adicionales , la base de anchura y las décadas positivas según sea necesario.

Seleccione las células CD3 positivas, CD8 positivas haciendo clic en Polígono. Haga doble clic en el centro de la puerta CD3-positivo, CD8-positivo para mostrar las celdas en un gráfico de puntos con Tetr-gag en el eje x y Pent-gag en el eje y. Seleccione las células T CD8 específicas de antígeno haciendo clic en Polígono. Haga doble clic en el centro de la puerta específica de la mordaza para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con DNA-A en el eje x y Ki67 en el eje y. Seleccione las celdas en las diferentes fases del ciclo celular haciendo clic en Quad en la sección Herramientas de compuerta de la ventana del gráfico.