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Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga una suspensión unicelular de células mieloides de retina de ratón, incluida la microglía, los monocitos y los neutrófilos.
La microglía, o células inmunitarias fagocíticas de la retina, exhibe fluorescencia debido a biopartículas de origen fúngico marcadas con fluoróforo engullidas, preinyectadas por vía intravítrea.
Centrifugar y agregar anticuerpos contra el receptor de Fc, bloqueando sitios de interacción no específicos".
Introduzca un cóctel de anticuerpos marcados con fluoróforo dirigidos a las proteínas de superficie CD11b, Ly6C y Ly6G, interactuando con las células mieloides que las expresan.
Eliminar los anticuerpos no unidos. Tratar con yoduro de propidio, que penetra a través de las membranas dañadas, tiñendo exclusivamente las células muertas.
En citometría de flujo, excitar el yoduro de propidio para excluir las células muertas e identificar las células vivas no fluorescentes.
Ilumine las células con un láser violeta; las células vivas excitadas significan las células mieloides que expresan CD11b.
A continuación, ilumine con un láser rojo, excitando el fluoróforo rojo cercano dentro de las células positivas para CD11b, lo que indica monocitos que expresan Ly6C y neutrófilos que expresan Ly6G.
Excite las células con un láser azul; la emisión de fluorescencia verde de las células CD11b positivas restantes confirma la captación microglial de partículas fluorescentes.
Tres horas después de la inyección intravítrea, use pinzas en ángulo de 45 grados para presionar suavemente contra el párpado para apuntalar el globo ocular. Coloque las pinzas detrás del globo ocular y tire. Luego, transfiera el globo ocular al área seca de una placa de Petri que contenga un pequeño volumen de PBS con calcio y magnesio bajo un microscopio de disección, y use una punta de las pinzas súper finas para perforar el ojo en el limbo corneal. Luego, sosteniendo el globo ocular con pinzas finas en ángulo de 45 grados, use tijeras de resorte para cortar alrededor del limbo corneal hasta que se corte aproximadamente la mitad de la circunferencia.
Transfiera el globo ocular a PBS y use un segundo par de pinzas finas en ángulo de 45 grados para separar la córnea y la esclerótica. El cristalino y la retina saldrán intactos. Asegúrese de que el cristalino y la retina estén separados y transfiera la retina a un tubo de ensayo de poliestireno de 5,4 mililitros que contenga 2 mililitros de PBS con calcio y magnesio.
Para obtener una suspensión unicelular de las células de la retina, use un kit de disociación de tejido neuronal de acuerdo con las instrucciones del fabricante y vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción. Luego, transfiera la muestra a un pocillo de una placa de fondo en U de 96 pocillos. Después de la centrifugación, invierta la placa para desechar el sobrenadante y bloquee los receptores FC con 25 microlitros de tampón de tinción que contenga anticuerpos CD16/CD32 por pocillo durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, etiquete las células con los anticuerpos de interés durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
Luego, peletice las células y siga esto con un lavado en 200 microlitros de tampón de tinción fresco por pocillo. Ahora, vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de tampón de manchas y tinte de viabilidad y transfiera las muestras a tubos de microtitulación de 1,2 mililitros. Luego, lave los pocillos con 100 microlitros adicionales de tampón de tinción y colorante de viabilidad y combine los lavados con las muestras correspondientes para su análisis por citometría de flujo.