Uso de sondas de tensión basadas en ADN para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias

Comience con un cubreobjetos de vidrio funcionalizado con nanopartículas de oro ancladas con polietilenglicol.

Agregue sondas de tensión de horquilla de ADN que contengan una horquilla de ADN hibridada con dos oligonucleótidos en brazos opuestos.

La hebra del ligando incluye un fluoróforo y biotina, mientras que la hebra de anclaje contiene un extintor y un grupo tiol. En esta configuración, el apagador suprime la fluorescencia.

Las sondas de ADN se unen a las nanopartículas de oro, anclándose al cubreobjetos de vidrio.

Introducir estreptavidina, interactuando con las moléculas de biotina de las hebras de ligandos.

Agregue ligandos biotinilados que se unan a moléculas de estreptavidina preunidas.

Superponga el cubreobjetos con células T CD8 positivas; sus receptores interactúan con ligandos inmovilizados, formando un sitio de interacción receptor-ligando.

Esta interacción genera una fuerza que despliega la estructura de horquilla del ADN, separando el fluoróforo del extintor y promoviendo la emisión de fluorescencia.

Introduzca hebras de bloqueo no fluorescentes que interactúen con los segmentos desplegados de las sondas para preservar la señal de fluorescencia.

Cuantificar la fluorescencia para evaluar las fuerzas receptoras aplicadas por las células inmunitarias.

Para comenzar, coloque cubreobjetos de 25 milímetros en una rejilla de politetrafluoroetileno en un vaso de precipitados de 50 mililitros y enjuague los cubreobjetos tres veces sumergiéndolos en agua. Mezcle volúmenes iguales de etanol y agua, y agregue 40 mililitros de esta solución al vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos. Luego, selle el vaso de precipitados con cinta de parafilm.

Limpie los cubreobjetos sonicando el vaso de precipitados durante 15 minutos en un limpiador ultrasónico y deseche el líquido después de la sonicación. A continuación, enjuague el vaso de precipitados que contiene la rejilla y los cubreobjetos con agua, al menos, seis veces para eliminar cualquier resto de disolvente orgánico. Para preparar una solución de piraña fresca, agregue 30 mililitros de ácido sulfúrico a un vaso de precipitados de 50 mililitros y agregue lentamente 10 mililitros de peróxido de hidrógeno. Mezcle suavemente la solución de piraña con el extremo de una pipeta de vidrio.

Para iniciar el grabado, transfiera la rejilla que contiene los cubreobjetos al vaso de precipitados que contiene la solución de piraña e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente para limpiar e hidroxilar los cubreobjetos. Luego, transfiera la rejilla con pinzas de acero o politetrafluoroetileno a un vaso limpio de 50 mililitros y enjuague con agua seis veces. Para eliminar el agua por completo, sumerja la rejilla que contiene los cubreobjetos en un vaso de precipitados de 50 mililitros con 40 mililitros de etanol, luego, deseche el etanol.

A continuación, sumerja la gradilla en 40 mililitros de etanol que contenga un 3% de aminopropil trietoxisilano durante 1 hora a temperatura ambiente para iniciar la reacción con el grupo hidroxilo en los cubreobjetos. Enjuague la superficie del cubreobjetos seis veces sumergiéndolos en 40 mililitros de etanol y séquelos en un horno a 80 grados centígrados durante 20 minutos.

Cubra el fondo interior de la placa de Petri con cinta de parafilm para evitar que los cubreobjetos se deslicen dentro de la placa de Petri. Luego, coloque los cubreobjetos cubiertos de aminas con el lado a funcionalizar con las sondas de tensión de ADN hacia arriba. Cubra los cubreobjetos a menos 20 grados centígrados para uso futuro.

Para modificar los grupos amina en los cubreobjetos, agregue ácido lipoico-PEG-NHS y mPEG-NHS e incube la placa de Petri a temperatura ambiente durante 1 hora. Al final de la incubación, enjuague la superficie tres veces con agua. Después de eso, agregue 100 microlitros de bicarbonato de sodio 0.1 molar que contenga 1 miligramo por mililitro de acetato de sulfo-NHS a un juego de cubrebocas sándwich e incube durante 30 minutos para que se produzca la pasivación.

Agregue 0,5 mililitros de nanopartículas de oro a cada cubreobjetos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague los cubreobjetos con agua tres veces. Después de agregar la hebra de extinción de agujeros negros 2 a la sonda de tensión de ADN recocido en una proporción de 10 a 1, agregue 100 microlitros de la mezcla por dos cubreobjetos para hacer el sándwich.

Coloque con cuidado una bola de tejido de laboratorio húmeda en la placa de Petri lejos de los cubreobjetos y selle la placa con cinta de parafilm para evitar que la solución se seque. Después de eso, cubra el plato con papel de aluminio e incube a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, ensamble la cámara de imágenes teniendo cuidado de evitar grietas en la superficie mientras aprieta la cámara. Luego, agregue de 0.5 a 1 mililitros de solución salina equilibrada de Hank a la cámara de imágenes.

Utilice el canal Cy3B con un objetivo de 100x para capturar señales fluorescentes de células colocadas en las sondas de tensión de horquilla de ADN cuando comienzan a propagarse. Después de preparar 100 hebras de bloqueo micromolares no fluorescentes, en el punto de tiempo deseado, agréguelo a las células a una concentración final de 1 micromolar en la cámara de imágenes para almacenar la señal de tensión y mézclelo con las células mediante pipeteo.

Después de unos 10 minutos de bloqueo, adquiera películas de lapso de tiempo o imágenes de punto final en epifluorescencia tanto para el mapeo de tensión cualitativa como para el análisis cuantitativo.