Evaluación en tiempo real de la actividad antifúngica de las células inmunitarias humanas primarias

Comience con un plato de imágenes a base de vidrio que contenga una suspensión de neutrófilos humanos, o células inmunes, y visualícelo bajo un sistema de imágenes de fluorescencia.

Introduzca conidios fluorescentes de Aspergillus modificados genéticamente, o esporas de hongos, y capture imágenes a intervalos regulares de hasta 6 horas.

Las esporas de hongos expresan proteínas fluorescentes rojas y están marcadas externamente con fluoróforos magenta no degradables, lo que ayuda a distinguir las células muertas de las vivas.

Durante la incubación, los neutrófilos interactúan con moléculas asociadas a patógenos en conidios a través de receptores de reconocimiento de patrones, lo que facilita su engullimiento dentro de un fagosoma.

Más tarde, el fagosoma se fusiona con el lisosoma que contiene enzimas, formando un fagolisosoma.

Dentro del fagolisosoma, las especies reactivas de oxígeno y las enzimas degradan los conidios.

Durante las imágenes de células vivas, en el punto de tiempo inicial, la fluorescencia intensa de color rojo y magenta dentro del fagosoma de los neutrófilos indica la presencia de conidios vivos.

Con el tiempo, una disminución de la fluorescencia roja con la retención de fluorescencia magenta indica la degradación de los conidios, lo que confirma la actividad antifúngica de los neutrófilos.

Para visualizar DsRed y AlexaFlour 633 durante la microscopía, precaliente un calentador de microscopio y encienda el microscopio y la computadora. A continuación, agregue 100 microlitros de 3 por 10 a la 6ª suspensión conidial FLARE por mililitro a los pocillos apropiados del plato de imágenes. Registre el tiempo en que se agregan los conidios FLARE.

Monte el plato de imágenes en la platina del microscopio. A continuación, en los ajustes de adquisición, establezca la potencia del láser en el 10% y el tiempo de exposición en un segundo, y ajuste la sensibilidad de la cámara para obtener una imagen clara pero no sobreexpuesta de DsRed y AF 633, y configure una lista de puntos de la etapa. Inicialice las imágenes cuando todos los puntos estén enfocados, los canales fluorescentes estén optimizados y se establezcan el tiempo y la duración del ciclo.