Un ensayo celular para la identificación de agentes que interactúan con CXCR4

Tome una placa de pocillos múltiples recubierta de gelatina que contenga células de cáncer cerebral humano adheridas que expresan CXCR4.

Reemplace los medios con un tinte sensible al calcio. Las esterasas intracelulares escinden el tinte en un producto impermeable a la membrana que se une a los iones de calcio, exhibiendo una mayor fluorescencia.

Retire el tinte, lave y agregue tampón.

Coloque la placa en un lector de microplacas de fluorescencia con placas que contienen compuestos que interactúan con CXCR4 y quimiocinas que contienen CXCL12.

Usando parámetros automatizados establecidos, inyecte concentraciones crecientes de compuestos en pozos de prueba, seguido de una concentración específica de CXCL12.

En pocillos de control sin el compuesto, CXCL12 se une a CXCR4.

Esta unión activa una cascada de señalización, liberando iones de calcio en el citoplasma, donde se unen al tinte, intensificando la fluorescencia.

Sin embargo, en los pocillos de prueba, los compuestos que interactúan inhiben la unión de CXCL12 a CXCR4, lo que afecta la movilización de calcio y provoca una disminución de la fluorescencia dependiente de la dosis, confirmándolos como antagonistas de CXCR4.

El día del paso celular, cubra cada pocillo de una placa de poliestireno de 96 pocillos de paredes negras con fondos transparentes con 100 microlitros de solución de gelatina al 0,1% e incube las placas durante dos horas a temperatura ambiente. Mientras la gelatina se solidifica, use una solución de tripsina-EDTA para levantar las células de interés del fondo de su matraz de cultivo, resuspendiendo las células en medio de crecimiento fresco en un tubo cónico de 50 mililitros una vez que se hayan desprendido.

Después del recuento, recolecte las células por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en un medio de crecimiento fresco a una concentración de 1 x 10⁵ células viables por mililitro. Cuando las placas estén listas, deseche el exceso de solución de gelatina y seque las placas en un pañuelo de papel de laboratorio. Luego, lave los pocillos con 200 microlitros de PBS y reemplace el lavado con 200 microlitros de células por pocillo, para una incubación nocturna a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

A la mañana siguiente, golpee la placa para desechar el medio de crecimiento de los pocillos y seque la placa boca abajo sobre una toalla de papel. Luego, etiquete las células en cada pocillo con 100 microlitros de solución de colorante de carga por pocillo e incube la placa durante 45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Mientras las células se incuban, agregue 75 microlitros de CXCL12 por pocillo a la placa de quimiocinas y 50 microlitros del compuesto de interés a cada pocillo de la placa compuesta.

A continuación, encienda la unidad de enfriamiento del lector de placas de fluorescencia, seguido del propio lector de placas. Después de permitir que el sistema se inicie unos minutos, abra el software del lector de placas. Para configurar el protocolo de ensayo, en la pestaña Configuración, seleccione Modo de lectura y la longitud de onda de excitación y emisión adecuada para el colorante de carga.

Seleccione la pestaña "Mezclar con fluido de transferencia" para mezclar automáticamente los compuestos en la placa de compuestos. En la pestaña "Fluido de transferencia", ajuste 20 microlitros de cada pocillo de la placa compuesta para transferirlos a la placa de medición y coloque las puntas de la pipeta a 20 microlitros por debajo de la superficie del líquido. Establezca la velocidad de aspiración en 50 microlitros por segundo y la velocidad de dispensación en 25 microlitros por segundo y haga clic en "Leer con fluido de transferencia".

Durante el primer intervalo, seleccione 60 lecturas con un intervalo de tiempo de lectura de un segundo con 10 lecturas que se registrarán antes de que los compuestos se dispensen en la placa de medición y 50 lecturas que se completarán después. Establezca el segundo intervalo con el tiempo de intervalo de lectura de 30 segundos y 18 lecturas. Seleccione tres lavados de puntas para el protocolo, configurando cada paso de lavado para incluir el líquido de lavado adecuado, un ciclo de lavado, una velocidad de bomba rápida y cinco pasadas por lavado.

Utilice la función "Pausa del pipetador" para incluir una pausa de la pipeta de 300 segundos y utilice el ajuste "Mezclar con fluido de transferencia" para permitir la mezcla automática de la solución CXCL12 dentro de la placa de quimiocinas. En la siguiente pestaña "Fluido de transferencia", coloque 25 microlitros de cada pocillo de la placa de quimiocina para transferirlos a la placa de medición y coloque las puntas a 20 microlitros por debajo de la superficie del líquido. Establezca la velocidad de aspiración en 50 microlitros por segundo y la velocidad de dispensación en 25 microlitros por segundo.

Utilice el botón "Leer con fluido de transferencia" para configurar el primer intervalo para incluir 145 lecturas con un tiempo de intervalo de lectura de un segundo. Establezca el segundo intervalo en un tiempo de intervalo de lectura de seis segundos y 20 lecturas. Seleccione tres ciclos más de punta de lavado, luego haga clic en "Establecer temperatura de escenario" y configure la temperatura del dispositivo a 37 grados Celsius.

Al final de la incubación del tinte de carga, deseche el tampón de la placa de medición y seque la placa en un pañuelo de papel de laboratorio. Lave las células con 150 microlitros por pocillo de tampón de ensayo, reemplazando el tampón con 80 microlitros de tampón de ensayo después de dos minutos. Coloque la placa de medición en la posición de lectura, la placa compuesta en la posición de la fuente 2, la placa de quimiocinas en la posición de la fuente 3 y una caja de puntas negras en la posición de la fuente 1.

Cierre el dispositivo y haga clic en "Prueba de señal de protocolo" para determinar las unidades de luz relativa de fondo y las variantes de fluorescencia sobre la placa. Seleccione "Señal" de prueba en la ventana emergente. Si se obtienen valores de fondo de 8.000 a 10.000 unidades de luz relativas, seleccione "Actualizar" y haga clic en "Guardar" para guardar el protocolo principal.