Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:04 min. • July 8th, 2025
Comience con una ADNzima de escisión de ARN, un ADN catalítico que, al unirse a un biomarcador bacteriano específico, se activa.
La DNAzyme está unida a una perla magnética recubierta de estreptavidina a través de biotina en su extremo 5'. En el extremo 3', está unido a una ureasa ligada a oligonucleótidos, formando una perla magnética funcional.
A un tubo que contenga perlas magnéticas funcionales, agregue un lisado de E. coli.
Un biomarcador específico de E. coli del lisado activa la ADNzima, desencadenando la escisión del enlace ARN, provocando el desprendimiento del conjugado ADNzima-ureasa.
Utilice un soporte magnético para inmovilizar las perlas y retire el conjugado ADNzyme-ureasa unido a las perlas.
Transfiera el sobrenadante que contiene ureasa liberado a otro tubo.
Agregue un tinte indicador de pH: rojo de fenol y una solución de urea.
La ureasa hidroliza la urea en amoníaco y dióxido de carbono.
El amoníaco, una base débil, eleva el pH de la solución, provocando un cambio de color, que indica la presencia del biomarcador E. coli.
Después de preparar las células de E. coli de acuerdo con el protocolo de texto, prelave un tubo de microfuga de 1,5 mililitros agregando y agitando 100 microlitros de RB. A continuación, deseche el búfer.
Agregue 15 microlitros de EC1 ensamblado al tubo lavado, luego, coloque el tubo en la rejilla magnética y aspire el sobrenadante. Retire el tubo de la gradilla, agregue 100 microlitros de RB y vuelva a suspender con cuidado las perlas magnéticas.
Después de usar RB para lavar las perlas dos veces más y quitar el RB, agregue 10 microlitros de la muestra de E. coli al tubo y mezcle suavemente el contenido golpeando el tubo. Luego, incube la reacción a temperatura ambiente durante una hora.
Después de la incubación, agregue 90 microlitros de agua doblemente destilada y coloque el tubo en la rejilla magnética. Después de aproximadamente tres minutos de separación magnética, transfiera cuidadosamente 85 microlitros del sobrenadante a un tubo de microfuga de 0,5 mililitros.
Es muy importante pipetear la solución con cuidado sin recoger ninguna de las perlas magnéticas. Estas perlas están cargadas de ureasa y generarán una señal falsa positiva.
Agregue 15 microlitros de rojo de fenol al 0,04% y 100 microlitros de solución de sustrato. Luego, tome fotografías a intervalos de tiempo específicos para registrar un cambio de color.