Un ensayo reportero de luciferasa para estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por Poxvirus
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:07 min. • July 8th, 2025
Tomemos los complejos de transfección que comprenden ARNm reporteros que codifican para luciferasa de luciérnaga, o Fluc, y luciferasa Renilla, o Rluc.
El ARNm de Fluc contiene una secuencia de poliadenosina 5', o un líder poli(A), mientras que el ARNm de Rluc carece de esta secuencia.
Transfecte células de mamíferos no infectadas e infectadas con poxvirus para administrar los ARNm reporteros e incubar.
En las células no infectadas, los factores de iniciación eucariotas se unen a la tapa 5' del ARNm, seguidos del reclutamiento de la subunidad ribosómica pequeña y un ARNt iniciador.
Cuando la subunidad pequeña localiza el codón de inicio, la subunidad grande se une para sintetizar proteínas luciferasas.
En las células infectadas, la fosforilación mediada por poxvirus de la pequeña subunidad provoca el ensamblaje del ribosoma directamente en la secuencia líder, lo que mejora la producción de Luuc.
Lisar las células para liberar las luciferasas.
Añade el sustrato de Tulc, que la enzima oxida, emitiendo luz. Con un lector de placas, mida la luminiscencia.
Repita el paso para que Rluc determine el aumento relativo de la luminiscencia de Fluc en comparación con Rluc en las células infect
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