Un ensayo molecular para cuantificar los virus de la influenza A y B
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 3:49 min • July 8th, 2025
Tome un sistema de detección molecular que contenga un receptor de muestra precargado, un cartucho de transferencia y una base de prueba.
La base de prueba tiene tubos de reacción que contienen cebadores T1 y T2 con sitios de muesca y regiones de reconocimiento de influenza A y B, una mezcla de enzimas y balizas moleculares con un fluoróforo y un exterminador.
Transfiera las muestras nasofaríngeas que contienen virus en un tampón de lisis desde el receptor de muestras a la base de prueba.
La lisis viral libera ARN, seguida de la unión del cebador T2 a la región diana del ARN y la extensión por transcriptasa inversa.
El otro cebador T2 se une al mismo ARN, desplazando la hebra inicialmente extendida.
El cebador T1 se une a la hebra desplazada y la ADN polimerasa la extiende. Una enzima de muesca corta su sitio, con polimerización y desplazamiento de hebras, formando ADN bicatenario.
El proceso continúa, amplificando dúplex con voladizos monocatenarios.
Las balizas moleculares interactúan con los voladizos, separando el fluoróforo del extintor y produciendo fluorescencia para cuantificar la influenza A y B.
Para comenzar el proceso de prueba, toque Ejecutar prueba en la pantalla del instrumento. A continuación, ingrese la identificación del paciente usando el teclado en pantalla o el escáner de código de barras y presione OK. Después de eso, abra la tapa e inserte el tubo de la base de prueba naranja en el soporte de la base de prueba naranja. Confirme que se muestra la prueba correcta en la pantalla y presione OK. Luego, inserte el receptor de muestra azul en el soporte del receptor de muestra azul y espere a que el receptor de muestra se caliente. Después, retire el sello de aluminio colocando dos dedos en el borde del receptor de muestras para asegurarse de que permanezca en su lugar.
Luego, coloque el hisopo del paciente para analizarlo en el receptor de muestras. Mezcle vigorosamente el hisopo en el líquido durante 10 segundos y presione la cabeza del hisopo contra el costado del receptor de muestras para ayudar a desalojar la muestra del hisopo. Si los hisopos de prueba se almacenan en un medio de transporte viral, agite el medio de transporte viral durante 10 segundos y agregue 200 microlitros al receptor de la muestra. Luego, presione OK para continuar.
Después de eso, presione el cartucho de transferencia blanco en el receptor de muestra azul. Continúe presionando el receptor de muestras hasta que se eleve el indicador naranja. Luego, levante y conecte el cartucho de transferencia a la base de prueba. El indicador naranja debe descender una vez que la transferencia del cartucho esté colocada correctamente. Cierre la tapa y no la abra hasta que aparezca la pantalla de resultados.
Ahora, toque Ejecutar prueba de control de calidad en la pantalla de inicio. Seleccione la prueba de control de calidad que se va a ejecutar. A continuación, confirme el tipo de prueba para que coincida con la muestra de control de calidad destinada a la prueba haciendo clic en Aceptar y siguiendo las indicaciones en pantalla para completar la prueba. Una vez completada la prueba, observe los resultados de la prueba que se muestran en la pantalla con interpretaciones para detectar la presencia de influenza A, B o subtipos desconocidos y repita la prueba para obtener resultados no válidos.
Descripción general
Este artículo describe un sistema de detección molecular para cuantificar Influenza A y B mediante una serie de cebadores, enzimas y balizas moleculares. El proceso implica transferir muestras nasofaríngeas a una base de prueba, donde el ARN viral se amplifica y detecta mediante fluorescencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología molecular
- Virología
- Pruebas diagnósticas
Antecedentes
- Los virus de la influenza son patógenos importantes que afectan la salud respiratoria.
- Los métodos de detección rápida y precisa son cruciales para una gestión eficaz.
- Los sistemas de detección molecular utilizan la amplificación del ácido nucleico para lograr sensibilidad.
- Este estudio se centra en un método específico de detección que emplea cebadores y balizas moleculares.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para detectar la influenza A y B.
- Mejorar la rapidez y precisión de los diagnósticos de influenza.
- Utilizar la fluorescencia para cuantificar la presencia viral.
Métodos Utilizados
- Preparación de un sistema de detección molecular con cebadores específicos y enzimas.
- Transferencia de muestras nasofaríngeas a un tampón de lisis para la extracción de ARN.
- Amplificación del ARN viral mediante una serie de reacciones enzimáticas.
- Detección de los productos amplificados utilizando balizas moleculares para la medición de fluorescencia.
Resultados principales
- Amplificación exitosa de ARN de Influenza A y B a partir de muestras.
- La detección de fluorescencia se correlacionó con la presencia de ARN viral.
- Se demostró la eficiencia del sistema de detección en un entorno clínico.
- Se proporcionaron interpretaciones claras de los resultados de las pruebas respecto a los subtipos de influenza.
Conclusiones
- El sistema de detección molecular es efectivo para el diagnóstico rápido de la influenza.
- La detección basada en fluorescencia ofrece alta sensibilidad y especificidad.
- Este método puede mejorar los resultados clínicos mediante una detección oportuna.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación rápida y específica de los virus de la influenza A y B apoya la selección en etapas tempranas y la validación de objetivos en programas de enfermedades infecciosas. La lectura basada en fluorescencia del ensayo permite la evaluación cuantitativa de la eficacia de compuestos antivirales en modelos preclínicos. Este enfoque mecanicista de reducción de riesgos mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes para terapias respiratorias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de los mecanismos de replicación viral y la validación específica de vías diana.
- Valor operativo: Proporciona una señal cuantitativa de fluorescencia para el análisis de respuesta frente a dosis en cribados antivirales.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo mecanicista al correlacionar la interacción con el blanco con la reducción de la carga viral.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera señales estandarizadas y reproducibles para la evaluación de compuestos de alto rendimiento.
- Valor operativo: Utiliza la amplificación en tubo cerrado para minimizar el riesgo de contaminación y garantizar la robustez del ensayo.
- Valor traslacional: Prepara sistemas biológicos validados para estudios posteriores de eficacia preclínica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mide los niveles de ARN viral en sistemas relevantes para la enfermedad para evaluar la actividad antiviral.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal de la dinámica viral en modelos preclínicos.
- Valor predictivo: Orienta las decisiones de avance ajustadas al riesgo basándose en la supresión viral cuantitativa.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento de antivirales, desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder y las pruebas de eficacia preclínicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis de inhibidores de la polimerasa viral o de la entrada mediante la cuantificación directa de la replicación viral.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas de fluorescencia basadas en balizas, adecuadas para la miniaturización y automatización del ensayo.
- Análisis: Genera señales de fluorescencia proporcionales que permiten la determinación de la IC50 y la modelización de relaciones estructura-actividad.
- Investigación Traducional: Conecta el mecanismo de acción con los resultados fenotípicos en modelos infectados con influenza.
- Reutilización Empresarial: Reutilizable en cepas de influenza A y B para programas terapéuticos panvirales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios sobre el modo de acción antiviral.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante cartuchos de reactivos estandarizados y controles integrados.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos cuantitativos de eficacia tempranos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización basada en riesgos de candidatos con perfiles sólidos de supresión viral.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en virología molecular y detección basada en fluorescencia.
- Depende de instrumentación exclusiva para la transferencia de muestras, amplificación y adquisición de señales.
- Necesita estandarización entre equipos en los protocolos de manejo y lisis de muestras.
- La adaptación a otros virus respiratorios puede requerir el rediseño de cebadores y sondas marcadoras.
- Limitación práctica: la duración del ensayo y la estabilidad de los reactivos pueden afectar el rendimiento en cribados a gran escala.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
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Última actualización: 29 agosto 2026