Un método de microtitulación en placa para evaluar la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico

Tome placas de microtitulación que contengan un antibiótico aminoglucósido diluido en serie. Una de las placas contiene NTBC, una droga sintética.

Introducir Pseudomonas aeruginosa, una bacteria gramnegativa, e incubar.

La bacteria produce piomelanina, un pigmento extracelular protector, en los pocillos no tratados con NTBC, mientras que el medicamento previene la producción de piomelanina.

El antibiótico catiónico se une a los lipopolisacáridos aniónicos, o LPS, en la membrana externa bacteriana, desplazando los puentes catiónicos y desestabilizando la membrana.

Al ingresar a la bacteria, el antibiótico se une al sitio aminoacilo, o sitio A, en la subunidad ribosómica 30S.

El antibiótico unido evita la unión aminoacil-ARNt y el movimiento ribosómico a través del ARNm, interfiriendo con la síntesis de proteínas e inhibiendo el crecimiento bacteriano.

Después de la incubación, mida la densidad óptica del cultivo para evaluar el crecimiento bacteriano.

La concentración de antibióticos más baja que previene el crecimiento bacteriano es la concentración inhibitoria mínima o MIC.

Los valores similares de CMI para pocillos tratados con NTBC y no tratados con NTBC indican que no hay impacto de NTBC en la sensibilidad a los antibióticos de las bacterias.

Un día antes del ensayo de CIM, prepare cultivos de las cepas que se probarán en LB con y sin 2-[2-nitro-4-trifluorometil)benzoil]-1-3 ciclohexanodiona o NTBC. Esta demostración utiliza el nivel representativo de 300 micromolares de NTBC. El método de titulación para determinar la concentración adecuada de NTBC se describe en el texto del protocolo. Incube los cultivos durante la noche a 37 grados centígrados con aireación. Al día siguiente, haga LB más NTBC y LB más soluciones maestras DMSO para el ensayo MIC.

Para probar un antibiótico para una cepa, agregue 600 micromolares de NTBC a 2 mililitros de LB y mezcle para hacer la solución maestra de NTBC. El NTBC se agrega a una concentración de 600 micromolares porque se diluirá dos veces cuando se agregue el inóculo, lo que produce una concentración final de 300 micromolares. Agregue un volumen equivalente del DMSO del vehículo a 2 mililitros de LB y mezcle para hacer la solución maestra sin NTBC. Estas dos soluciones maestras se utilizarán para crear soluciones madre de antibióticos, así como para configurar la serie de dilución en placas de 96 pocillos.

A continuación, prepare las soluciones antibióticas en las soluciones maestras LB más NTBC o LB más DMSO. Prepare la gentamicina más o menos la solución madre de NTBC a 64 microgramos por mililitro. Prepare la solución madre de kanamicina más o menos NTBC a 256 microgramos por mililitro. Prepare la solución madre de tobramicina más o menos NTBC a 8 microgramos por mililitro.

Después de que se hayan hecho las soluciones antibióticas 2X, agregue 100 microlitros de cada solución antibiótica a cuatro pocillos en una placa de 96 pocillos en la fila A. Por ejemplo, la gentamicina debe colocarse en A1 a A4. La kanamicina debe colocarse en A5 a A8, y la tobramicina debe colocarse en A9 a A12.

Agregue 50 microlitros de la solución maestra LB más NTBC o LB más DMSO a las filas B a H de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que una placa sea LB más NTBC y una placa sea LB más DMSO. Con un cabezal de micropipeta, realice diluciones en serie dobles de los antibióticos transfiriendo 50 microlitros de la solución de la fila A a la fila B. Mezcle la solución, cambie las puntas de la pipeta y transfiera 50 microlitros de la solución de la fila B a la fila C. Repita para las filas restantes.

Después de diluir la fila G, retire 50 microlitros de la solución de esa fila y deséchela. Use la fila H como control sin antibióticos para el crecimiento bacteriano. Recupere los cultivos de la noche a la mañana. Después de lavar todos los cultivos para eliminar la biomelanina presente en el medio, medir el OD₆₀₀ de los cultivos. Diluir los cultivos durante la noche en LB.

Con una micropipeta multicanal, agregue 50 microlitros del cultivo bacteriano diluido a los pocillos apropiados. Agregue bacterias a tres pocillos para cada cepa y concentración de antibióticos. Agregue 50 microlitros de LB al cuarto pocillo para que actúe como control de la contaminación bacteriana. Cubra las placas de 96 pocillos con parafilm e incube durante aproximadamente 24 horas a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, examine las placas visualmente para detectar el crecimiento bacteriano en los pocillos. La CMI es la concentración más baja de antibiótico en la que no se observa crecimiento bacteriano para las tres réplicas de cada cepa.