JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
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Comience con una muestra que contenga virus obtenida de una córnea porcina infectada tratada con un medicamento antiviral.
Realice una dilución en serie de la muestra para crear una secuencia de concentraciones de virus decrecientes.
La dilución óptima previene la infección unicelular por múltiples virus.
Introduzca las muestras diluidas en una monocapa de célula huésped e incube.
El virus se adhiere al receptor de la célula huésped, ingresa a la célula e inicia su replicación. La célula infectada se lisa, liberando viriones.
Agregue metilcelulosa, una sustancia viscosa que confina los virus a las células cercanas.
Posteriormente, los virus causan la muerte celular y la formación de placa en la región infectada.
Agregue metanol para fijar las células.
Use violeta cristalina para teñir las células vivas.
Observe las placas como zonas claras que indican células infectadas y muerte celular, rodeadas de células no infectadas teñidas de violeta cristalino.
Finalmente, cuente el número de placas en la dilución más alta para cuantificar el título del virus en la solución inicial para determinar la eficacia del fármaco antiviral.
Para cuantificar la cantidad de virus recolectado de cada córnea, prepare una dilución log10 veces del virus en medio libre de suero en tubos de microcentrífuga hasta alcanzar una dilución de 1 x 10-8.
Después de aspirar el medio de crecimiento de cada pocillo de células, transfiera 1 mililitro de cada dilución de virus, comenzando en 1 x 10-3 a las monocapas de células en placas, y coloque las células infectadas en la incubadora de cultivo celular durante dos horas. Al final de la incubación, lave suavemente cada pocillo 2 veces con PBS antes de agregar 2 mililitros de medio cargado de metilcelulosa a cada pocillo durante una incubación de 72 horas, o hasta que se pueda observar la formación de placas.
Tras la observación de la placa, agregue lentamente 1 mililitro de metanol a la esquina de cada pocillo para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, aspire lentamente el contenido de cada pocillo sin alterar la monocapa celular.
Luego, etiquete cada pocillo con 1 mililitro de solución de trabajo de violeta cristalina, teniendo cuidado de que todas las células estén cubiertas para una incubación de 30 minutos protegidas de la luz. Al final de la incubación, deseche la solución y seque los pocillos en una hoja de papel absorbente. Luego, cuente el número de placas en el pozo de dilución más alto para cuantificar el contenido total de virus en la solución inicial 3 veces.