Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:57 min. • July 8th, 2025
Tome una placa de varios pocillos que contenga monocapas de células de mamíferos.
Semillas de pozos de prueba con el virus del herpes simple. Los pozos de control carecen del virus.
El virus se adhiere al sulfato de heparán de la superficie celular y se internaliza a través de la endocitosis.
La infección por virus desencadena la secreción de heparanasa, que escinde el sulfato de heparán y desenmascara receptores fúngicos específicos.
Co-incubar las células con tubos germinativos de Staphylococcus aureus y Candida albicans.
En las células infectadas por virus, el agotamiento del sulfato de heparán inhibe la interacción bacteriana al tiempo que promueve las interacciones de los receptores fúngicos, evitando la colocalización bacteriano-fúngica.
En las células de control, las bacterias interactúan con el sulfato de heparán, mientras que los hongos se unen a los receptores disponibles.
Esta colocalización microbiana inicia la adherencia, el primer paso en la formación de biopelículas.
Después de la incubación, elimine los microbios no unidos. Cubra con un tampón de lisis, liberando bacterias y hongos en el medio.
Extienda el lisado celular en placas que contengan medios de crecimiento. Incubar para la formación de colonias.
Una disminución de las colonias bacterianas con un aumento correspondiente de las colonias de hongos indica una inhibición inducida por el virus de la colocalización bacteriano-fúngica y la iniciación de la biopelícula.
Para realizar un ensayo de biofilm polimicrobiano, siembre placas de 96 pocillos con 200 microlitros de 2 por 10 a la 5ª células HeLa por mililitro. Agite las placas a 37 grados Celsius durante 30 a 45 minutos, antes de incubar en dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 18 horas. Utilice 1x óptimo para lavar las monocapas. Luego, siembre con una sola cepa de HSV. Prueba solo una cepa a la vez.
Incube las placas a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante tres horas. Usando 100 microlitros de PBS a 37 grados Celsius con magnesio y calcio, lave las monocapas infectadas. Luego, use HBSS a 37 grados Celsius para reemplazar el PBS. Deje 25 microlitros de HBSS en cada pocillo.
A continuación, agregue suspensiones de trabajo GT y / o S. aureus e incube las placas a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5% durante 30 minutos. Después de la incubación, aspire una columna de la placa a la vez. Rellene inmediatamente los pozos con 300 microlitros de PBS con magnesio y calcio.
Después de repetir este paso de lavado dos veces, agregue 200 microlitros a una dilución de 1 a 50 de tampón de lisis RIPA esterilizado por filtro a cada pocillo.
Cuando trabaje con otras cepas de bacterias u hongos, asegúrese de que la concentración de RIPA utilizada sea suficiente para la lisis celular, pero permisiva para las pruebas de viabilidad microbiana.
Triture rápidamente el lisado de células HeLa y pipetee 50 microlitros en sales de manitol y/o medio fungicida. Luego, usando una varilla de vidrio doblada en un ángulo de 90 grados, extienda el lisado sobre la superficie de la placa.
Después de incubar las placas durante 18 horas, cuente manualmente el número de colonias por placa. Los controles consisten en la adherencia de S. aureus y / o C. albicans a las células HeLa no infectadas por HSV.