Un ensayo de utilización de ATP para determinar la supervivencia bacteriana bajo tratamiento con antibióticos
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 2:56 min • July 8th, 2025
Comience sembrando un cultivo bacteriano en una placa de ensayo. Luego, incube el plato.
Las células bacterianas tienen adhesinas superficiales y pili que les permiten adherirse entre sí, formando pequeños agregados.
Agregue concentraciones variables de antibióticos a los pocillos, dejando uno sin tratar para un control.
Las moléculas de antibióticos interactúan con bacterias sensibles, afectando su capacidad para crecer y reproducirse, lo que lleva a su muerte.
Las bacterias resistentes a los antibióticos permanecen metabólicamente activas, produciendo moléculas de ATP.
Use un sonicador para alterar las células bacterianas, liberando su contenido intracelular, incluido el ATP.
Agregue reactivo de brillo de utilización de ATP que contenga luciferina, enzima luciferasa y otros cofactores.
La luciferasa utiliza ATP y oxígeno para convertir la luciferina en una oxiluciferina excitada.
Posteriormente, la oxiluciferina pasa a su estado fundamental, emitiendo luz luminiscente.
Mida la absorbancia con un lector de placas.
La disminución de la absorbancia a concentraciones más altas de antibióticos sugiere una menor producción de ATP, lo que indica una tasa de supervivencia bacteriana reducida.
Mida la densidad óptica a 650 nanómetros o OD650 para determinar la concentración de las bacterias suspendidas y ajuste la concentración de GC a aproximadamente 1 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro. A continuación, agregue 99 microlitros de la suspensión de GC en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y permita que las bacterias se agreguen a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 6 horas.
Al final de la incubación, agregue 1 microlitro de ceftriaxona diluida en serie a cada pocillo, dejando algunos pocillos sin tratar para que sirvan como controles, y devuelva la placa a la incubadora durante otras 24 horas. Al día siguiente, sonique la suspensión en cada pocillo tres veces a 144 vatios y 20 kilohercios durante 5 segundos por sonicación, y agregue 100 microlitros de reactivo de brillo de utilización de ATP disponible comercialmente a cada pocillo.
Transfiera cuidadosamente 150 microlitros de mezcla de cada pocillo a pocillos individuales de una nueva microplaca negra de 96 pocillos y mida la absorbancia de cada pocillo a 560 nanómetros en un lector de placas. Luego, calcule la tasa de supervivencia por la relación entre la lectura obtenida después del tratamiento con antibióticos en serie y la lectura de los pocillos no tratados.
Descripción general
Este estudio investiga los efectos de diferentes concentraciones de antibióticos sobre las tasas de supervivencia bacteriana mediante la detección luminiscente de ATP. La metodología incluye sembrar cultivos bacterianos, incubarlos y medir la producción de ATP para evaluar el impacto de los antibióticos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Resistencia a los antibióticos
- Metabolismo celular
Antecedentes
- Las células bacterianas pueden formar agregados mediante adhesinas y pili de superficie.
- Los antibióticos interactúan con bacterias sensibles, afectando su crecimiento y reproducción.
- La producción de ATP es un indicador clave de la actividad metabólica bacteriana.
- Los ensayos basados en luciferasa pueden medir los niveles de ATP mediante luminiscencia.
Objetivo del estudio
- Evaluar las tasas de supervivencia de bacterias bajo diferentes tratamientos con antibióticos.
- Utilizar la detección de ATP como medida de viabilidad bacteriana.
- Comprender la relación entre la concentración de antibiótico y la actividad metabólica bacteriana.
Métodos Utilizados
- Siembra de cultivos bacterianos en placas de ensayo e incubación.
- Aplicación de concentraciones variables de antibióticos y medición de niveles de ATP.
- Uso de un sonicador para romper las células bacterianas y liberar ATP.
- Empleo de luciferina y luciferasa para la detección luminiscente de ATP.
Resultados principales
- Concentraciones más altas de antibióticos dieron como resultado una disminución en la producción de ATP.
- Lecturas más bajas de absorbancia se correlacionaron con tasas reducidas de supervivencia bacteriana.
- Las mediciones de densidad óptica confirmaron los ajustes en la concentración bacteriana.
- Los pocillos de control mostraron niveles más altos de ATP en comparación con los pocillos tratados.
Conclusiones
- El tratamiento con antibióticos afecta significativamente la viabilidad bacteriana.
- La detección de ATP es un método eficaz para evaluar la supervivencia bacteriana.
- Comprender estas interacciones puede contribuir a la investigación sobre resistencia a antibióticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo basado en ATP proporciona una lectura cuantitativa basada en luminiscencia para la supervivencia bacteriana bajo presión de antibióticos, permitiendo la validación temprana de dianas en el descubrimiento de agentes antimicrobianos. Al vincular la actividad metabólica con la eficacia del compuesto, este método apoya la reducción de riesgos mecanicistas y brinda confianza predictiva en las campañas de identificación de compuestos líderes. El método es directamente aplicable a campañas de cribado dirigidas contra patógenos bacterianos en las que la supervivencia se correlaciona con el efecto terapéutico pretendido.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mide la supervivencia bacteriana como una lectura funcional del acoplamiento al blanco y la inhibición de la vía.
- Valor operativo: Permite una evaluación rápida y cuantitativa de los efectos del compuesto sobre la viabilidad microbiana.
- Valor estratégico: Facilita la comprobación de hipótesis y la reducción del riesgo asociado al blanco mediante la correlación entre la exposición al antibiótico y el rendimiento metabólico.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos de respuesta a la dosis a partir de la reducción de la señal de ATP para cuantificar la potencia de los antibióticos.
- Valor operativo: Utiliza lisis estandarizada y adición de reactivos para una detección de luminiscencia reproducible basada en placas.
- Valor estratégico: Permite el cribado escalable de compuestos con una lectura homogénea sin lavados, compatible con la automatización.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar la actividad antimicrobiana frente a patógenos clínicamente relevantes como Neisseria gonorrhoeae.
- Valor operativo: Ofrece métricas cuantitativas continuas de supervivencia que vinculan los hallazgos in vitro con la toma de decisiones preclínicas.
- Valor estratégico: Facilita la optimización de compuestos líderes al identificar aquellos que suprimen de forma sostenida la actividad metabólica bacteriana.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento de agentes antimicrobianos, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos líderes, donde las métricas de supervivencia orientan la priorización de compuestos antes de los estudios de eficacia preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis terapéuticas mediante la medición del agotamiento de ATP como indicador de muerte bacteriana tras la exposición a antibióticos.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos de luminiscencia reproducibles, que permiten ordenar por potencia los compuestos a diferentes concentraciones.
- Análisis: Genera cálculos de tasas de supervivencia mediante la relación entre las señales del grupo tratado y del grupo control, lo que facilita la determinación de la IC50 y la modelización de relaciones estructura-actividad.
- Investigación Traducional: Utiliza agregados de Neisseria gonorrhoeae como modelo clínicamente relevante para reflejar el comportamiento del patógeno en los nichos de infección.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada, basada en reactivos, aplicable a diversas especies bacterianas y clases de antibióticos para tamizajes a escala de cartera.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al vincular el tratamiento con compuestos a una pérdida medible de la actividad metabólica microbiana.
- Valor operativo: Garantiza la robustez del ensayo mediante la lisis celular y la cinética de reactivos estandarizadas, minimizando la variabilidad entre corridas.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir decisiones tempranas de continuar o descartar basadas en la cinética de supervivencia, en lugar de recuentos de UFC en el punto final.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de candidatos antimicrobianos mediante perfiles cuantitativos y estandarizados de supervivencia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de cultivos microbiológicos y manejo de patógenos bajo condiciones de bioseguridad.
- Depende del acceso a un luminómetro o lector de placas capaz de detectar absorbancia o fluorescencia a 560 nm.
- Necesita la estandarización de la agregación bacteriana y del tiempo de incubación para garantizar un rendimiento constante de ATP entre pozos.
- Implica la optimización de los parámetros de sonicación para lograr una lisis completa sin degradar los reactivos del ensayo.
- Limitado a bacterias metabólicamente activas; puede no distinguir entre estados viables pero no cultivables y la muerte celular verdadera.
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Última actualización: 22 agosto 2026