Determinación de la función de las células similares a los neutrófilos en la sensibilidad de las células de linfoma a un fármaco de prueba

Tome una placa de pocillos múltiples que contiene monocultivos esferoides 3D de células de linfoma, glóbulos blancos cancerosos y cocultivos de linfoma y células similares a neutrófilos en una matriz de membrana basal.

Agregue un fármaco de prueba que se una a la tubulina intracelular e interrumpa la polimerización de los microtúbulos, lo que resulta en apoptosis celular.

En el cocultivo, el contacto directo con las células del linfoma activa las células similares a los neutrófilos, induciendo la secreción de citoquinas.

Estas citocinas interactúan con los receptores de las células del linfoma, desencadenando cascadas de señalización aguas abajo y regulando al alza la expresión de proteínas antiapoptóticas, promoviendo la supervivencia celular.

Deseche el papel. Agregue un tampón de disociación para interrumpir la adhesión celular.

Raspe los esferoides e incube bajo agitación. Transfiera la suspensión a los tubos y continúe agitando para formar suspensiones unicelulares.

Introduzca un cóctel de anticuerpos conjugados con fluoróforos que etiquete el linfoma y las células similares a los neutrófilos.

Agregue anexina V marcada con fluoróforo y yoduro de propidio para etiquetar las células apoptóticas y muertas.

Mediante citometría de flujo, detecte una mayor supervivencia de las células de linfoma en el cocultivo, lo que indica una protección mediada por neutrófilos contra el fármaco.

Para configurar un cocultivo 3D, agregue 50,000 células B de linfoma RL solas, o mezcle con células diferenciadas HL60 en tubos estériles de 15 mililitros.

Gire las muestras y vuelva a suspender los gránulos en 300 microlitros de matriz de membrana basal utilizando una punta de pipeta de 1 mililitro con la abertura cortada de 2 a 3 milímetros. A continuación, incube 300 microlitros de las células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de CO2.

Al final de la incubación, agregue 1 mililitro de medio RPMI completo a cada pocillo y regrese a los cultivos 3D a la incubadora durante otros siete días con cambios de medio cada dos días. El día 5, agregue 10 vincristina nanomolar a los cultivos.

Después de una semana de cultivo, aspire el medio y lave cada pocillo 2 veces con 1 mililitro de PBS helado. Luego, agregue 3 mililitros de PBS helado con EDTA a cada pocillo y raspe el fondo de los pocillos con una punta de pipeta de 200 microlitros para separar los geles. Agite el plato suavemente sobre hielo durante 30 minutos. Luego, transfiera las suspensiones celulares a tubos estériles individuales de 15 mililitros para agitarlas suavemente con hielo durante otros 30 minutos.

Confirmar la aparición de una suspensión celular homogénea. Luego, gire las celdas, seguido de un lavado de PBS, y vuelva a suspender los gránulos en PBS fresco con FBS. Finalmente, etiquete las células con los anticuerpos apropiados y los colorantes de viabilidad como se acaba de demostrar, y analice las células diferenciadas por RL y HL60 mediante citometría de flujo utilizando la estrategia de compuerta ilustrada.