Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:46 min. • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples con cultivo de células madre mesenquimales adherentes, o MSC.
Agregue células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, e incube.
Las MSC secretan factor de crecimiento de hepatocitos, induciendo a los monocitos a adquirir un fenotipo inmunomodulador, produciendo interleucina-10 o IL-10.
Transfiera el sobrenadante que contiene PBMC a un tubo.
Agregue perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos que se unan al marcador de superficie de monocitos CD14.
Utilice un separador magnético para aislar los monocitos CD14+ y agréguelos a pocillos de placas de pocillos múltiples en concentraciones crecientes.
Introduzca células T efectoras CD4+ marcadas con CFSE de tinte fluorescente.
Agregue microperlas conjugadas con anticuerpos que se unan específicamente a los marcadores de superficie de las células T CD3 y CD28, activando las células.
En los monocitos de control que carecen de pozos, proliferan las células T activadas, y cada división celular disminuye la intensidad de fluorescencia CFSE en las células hijas.
Sin embargo, en los cocultivos, los monocitos inducidos por MSC secretan IL-10, suprimiendo la proliferación de células T efectoras.
Usando citometría de flujo, observe menos células T que exhiben intensidades de fluorescencia CFSE reducidas con concentraciones crecientes de monocitos, lo que indica la supresión de la proliferación de células T efectoras por monocitos inducidos por MSC.
Para realizar un ensayo de supresión de efectores, comience configurando un cocultivo MSC-PBMC con 2.5 x 106 PBMC, cocultivado con 250,000 MSC para garantizar suficientes PBMC cocultivados con MSC para la selección de subpoblaciones.
Después de 48 a 72 horas a 37 grados Celsius, seleccione los leucocitos inmunomoduladores inducidos por MSC de interés con las perlas magnéticas apropiadas. Luego, agregue células T CD4 positivas alogénicas marcadas con CFSE en 1 mililitro de medio leucocitario completo por pocillo, en varias proporciones experimentales.
A continuación, agregue microperlas conjugadas anti-CD3 / 28 en una proporción de 1 a 1 perlas por célula para estimular las células T CD4 positivas. En el tercer día de cocultivo, evaluar la proliferación de las células T CD4 positivas marcadas con CFSE mediante citometría de flujo.