JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 5:52 min • July 8th, 2025
Tome cámaras de flujo preensambladas conectadas a sistemas de flujo con filtros transwell: uno con un monocultivo endotelial en la parte superior y el otro con un cultivo endotelial en la parte superior y células estromales en la parte inferior.
Ambas cámaras están pretratadas con una citocina proinflamatoria.
En un monocultivo, las citocinas activan las células endoteliales, regulando al alza la expresión de la molécula de adhesión.
Sin embargo, la comunicación cruzada entre las células estromales y endoteliales en el cocultivo conduce a que las células estromales produzcan mediadores reguladores que regulan a la baja la respuesta de las células endoteliales a las citocinas proinflamatorias.
Coloque la cámara en una platina de microscopio de contraste de fase invertida.
Introduce una suspensión de neutrófilos.
Los neutrófilos se reclutan y se unen a las moléculas de adhesión endotelial a través de interacciones adhesivas transitorias, lo que facilita su interacción con las quimiocinas unidas a la superficie y rueda a lo largo del endotelio.
Esta interacción activa las integrinas en los neutrófilos, estabilizando la adhesión y dando como resultado la transmigración a través de las células endoteliales.
Sin embargo, en el cocultivo, la respuesta endotelial regulada a la baja da como resultado un reclutamiento de neutrófilos suprimido.
Visualice los cultivos bajo microscopía de contraste de fase para evaluar el reclutamiento de neutrófilos a partir del flujo.
Para el modelo de filtro, primero corte un trozo de Parafilm del mismo tamaño que el cubreobjetos de vidrio, utilizando una plantilla de metal. Luego, corte una ranura de 20 por 4 milímetros en el Parafilm usando una plantilla de metal para crear el canal de flujo. Utilice la junta Parafilm para marcar el canal de flujo en el cubreobjetos de vidrio. Alinee los bordes del filtro de seis pocillos en el cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que el filtro cubra las marcas del canal de flujo. Corte con cuidado el filtro con un bisturí tipo 10A.
A continuación, cubra cuidadosamente el filtro con una junta de Parafilm, asegurándose de que la ranura del canal de flujo esté en el medio del filtro. Use un trozo de pañuelo limpio y expulse las burbujas. Ahora, coloque el cubreobjetos en el hueco de la placa inferior de la cámara de flujo de metacrilato.
Coloque la placa superior de metacrilato sobre la parte superior de la junta y atornille las placas. Gire el grifo de tres vías para permitir que el tampón de lavado PBS-A fluya a través de la válvula. Luego, conecte el tubo del manómetro al puerto de entrada de la placa superior de metacrilato. Pase PBS-A a través del canal de flujo para permitir que pasen las burbujas.
Luego conecte el tubo del manómetro de la bomba de jeringa al puerto de salida de la placa de metacrilato. Limpie cualquier PBS-A que haya goteado sobre la placa superior de la cámara. Finalmente, coloque la cámara en la platina de un microscopio de contraste de fase invertido y ajuste el enfoque para visualizar las células endoteliales sobre los filtros.
Para perfundir leucocitos sobre células endoteliales, configure la bomba de jeringa para que se vuelva a llenar y presione Ejecutar. Una vez que se haya ajustado el enfoque para visualizar la monocapa de células endoteliales, coloque dos mililitros de neutrófilos purificados en el depósito de muestra y déjelo calentar durante dos minutos. Luego, lave el endotelio con PBS-A durante dos minutos. Abra la válvula para perfundir neutrófilos sobre el endotelio. Administre el bolo de neutrófilos durante cuatro minutos. Cierre la válvula y perfunda PBS-A del depósito de lavado durante el resto del experimento.
Al realizar el experimento, asegúrese de que las burbujas de aire no pasen en ningún momento durante el ensayo, ya que esto interrumpirá la monocapa de células endoteliales y provocará el desprendimiento de neutrófilos adherentes.
Registre el reclutamiento de neutrófilos durante el flujo de neutrófilos o después de la perfusión utilizando un software de captura de imágenes digitales. Identifique el centro del canal moviendo el objetivo al borde del canal en el puerto de entrada e identificando el centro del puerto. Realice todas las grabaciones digitales de al menos 5 a 10 campos en el centro del canal de flujo.
Mientras graba durante el flujo de neutrófilos, tome imágenes de un solo campo cada 10 segundos durante un minuto. Muévase a lo largo del canal y grabe otro campo durante un minuto, repitiendo este proceso durante la duración del bolo.
Para registrar la postperfusión, realice una grabación de 10 segundos de 5 a 10 campos en el centro del canal de flujo para evaluar el comportamiento de los leucocitos. Tome imágenes cada segundo dentro del intervalo de 10 segundos. Esto permite tiempo suficiente para la captura del flujo y el análisis del comportamiento de los neutrófilos adherentes.
Registre un solo campo que contenga al menos 10 neutrófilos transmigrados durante cinco minutos, tomando imágenes cada 30 segundos. Esto se puede utilizar para calcular la velocidad de las células migradas. Graba otra serie de campos de 10 segundos. Esto permite que los neutrófilos migren a través de la monocapa endotelial.
Finalmente, detenga la bomba de jeringa y retire el tubo de salida y luego el tubo de entrada. Desmonte la cámara de flujo y enjuague el depósito de muestras con PBS-A. Repita para los filtros posteriores y los canales de microportaobjetos antes de proceder al análisis del reclutamiento y el comportamiento de los leucocitos como se describe en el protocolo de texto.