Cuantificación basada en citometría de flujo de células cancerosas senescentes inducidas por terapia

Tomemos las células cancerosas pretratadas con un fármaco de quimioterapia que induce la senescencia en un porcentaje de células.

Estas células acumulan gránulos de lipofuscina autofluorescente, un marcador de senescencia conocido.

Agregue un antibiótico que ingrese a las células e inhiba las bombas de protones lisosomales, evitando la acidificación lisosomal.

Un aumento del pH inactiva las enzimas lisosomales.

Las células senescentes sobreexpresan la β-galactosidasa lisosomal incluso a pH casi neutro, lo que la convierte en un biomarcador de senescencia.

Introducir un sustrato de β-galactosidasa. Incubar.

La β-galactosidasa hidroliza el sustrato internalizado en un producto fluorescente, marcando las células senescentes.

Centrifugar y desechar el sobrenadante.

Agrega un tinte de viabilidad celular. Dentro de las células vivas, las esterasas activas convierten el tinte en un producto fluorescente impermeable a la membrana. Las células muertas con integridad de membrana comprometida permanecen sin teñir.

Mediante citometría de flujo, detecte las células viables que muestran los marcadores duales lipofuscina y sustrato fluorescente de β-galactosidasa, lo que indica células senescentes.

Cuantificar el porcentaje de células senescentes para demostrar la eficacia del fármaco.

Primero, ajuste el pH lisosomal de las muestras de células cultivadas agregando una solución de un micromolar de bafilomicina A en DMEM al sedimento celular a una concentración de uno por 10 a las seis células por mililitro, y pipeta para mezclar. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un rotador a baja velocidad. Luego, para teñir la beta-galactosidasa asociada a la senescencia, agregue solución madre de DDAOG a 10 microgramos por mililitro a las muestras sin lavar.

Colocar en un rotador durante 60 minutos, protegido de la luz directa. Como antes, centrifuga los tubos. Retire el sobrenadante y lave el gránulo con un mililitro de BSA helado al 0,5% en PBS. Luego, agregue 300 microlitros de solución diluida de violeta de calcina 450 AM a los gránulos de células lavadas. Incube durante 15 minutos en hielo en la oscuridad.

Transfiera las muestras celulares a tubos compatibles con instrumentos de citometría de flujo. En el software de adquisición de datos, abra un histograma de canal violeta y un diagrama de puntos de canal rojo lejano versus canal verde. Inicie la adquisición de datos del citómetro a una velocidad de entrada baja y coloque las muestras de control positivo teñidas con DDAOG en el puerto de admisión. Comience a adquirir datos de muestra. Ajuste los voltajes de canal de modo que más del 90% de los eventos estén contenidos dentro de cada gráfico.

Cuando todos los ajustes sean óptimos, registre 10.000 eventos por muestra. Coloque las muestras de control solo para vehículos teñidas con DDAOG en el puerto de admisión. Inicie la adquisición de datos y registre 10.000 eventos por muestra. Busque un aumento en la señal de galactósido de autofluorescencia o AF y DDAO versus control positivo. Guarde los datos de ejemplo en . FCS y exporte los archivos a una computadora de estación de trabajo equipada con software de análisis de citometría de flujo.