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Tome una placa de fondo plano de múltiples pocillos con pocillos que contengan bacterias en los medios de crecimiento o bacterias en los medios de crecimiento complementados con sal biliar.
Las sales biliares inducen estrés, causando daño celular y liberando ADN y proteínas. Estas biomoléculas recubren el fondo de los pozos, lo que permite que las bacterias supervivientes se adhieran a la superficie sólida.
Las bacterias adheridas se multiplican, formando microcolonias y produciendo autoinductores, o moléculas de señalización química, que permiten la comunicación bacteriana.
Esta comunicación desencadena la colonización de bacterias e inicia la producción de sustancias poliméricas extracelulares o EPS, generando una biopelícula.
Después de la incubación, retire el medio para eliminar las bacterias que flotan libremente.
Introducir una tinción violeta cristalina que interactúa con el peptidoglicano de la pared celular bacteriana, dándole un color violeta.
Elimina el exceso de mancha y seca. Cubra con etanol para solubilizar el violeta cristalino de la pared celular bacteriana, cambiando el color de la solución.
Una coloración más intensa en los pocillos tratados con sales biliares que en los pocillos no tratados confirma la formación de biopelículas a través de la adherencia a la fase sólida.
Primero, etiquete dos tubos de 1.5 mililitros como TSB y TSB más BS. Luego, agregue 1 mililitro de TSB o TSB más BS a los tubos respectivos.
A continuación, inocular los tubos con 20 microlitros de cultivo nocturno a una dilución de 1:50. Luego, agregue 130 microlitros de medios de control no inoculados a cada uno de los tres pocillos en una placa estéril, transparente, tratada con cultivo de tejidos de fondo plano y tratada con cultivo de 96 pocillos. Este será el control en blanco.
Agregue 130 microlitros de cultivo inoculado en cada uno de los tres pocillos. Después de agregar el testigo y el cultivo inoculado en los respectivos pocillos, incube la placa de 96 pocillos durante 4 a 24 horas a 37 grados centígrados de forma estática. Una vez finalizada la incubación, coloque el pozo de control en blanco en el lector de placas.
A continuación, aspire el medio de cultivo de cada pocillo. Luego lave suavemente los pocillos una vez con 200 microlitros de PBS estéril. Después del lavado, aspire el PBS y luego invierta la placa para que se seque durante unos 20 minutos.
Es muy importante garantizar una eliminación cuidadosa del medio y un lavado suave para garantizar que la matriz de EPS no se altere.
A continuación, agregue 150 microlitros de violeta cristalina al 0,5% a cada uno de los pozos experimentales y de control. Luego, incube la placa durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, lave los pozos una vez con 400 microlitros de agua destilada. Agregue 200 microlitros de agua destilada para lavar los pozos cinco veces. Después de los cinco lavados, invierta la placa y déjela secar por completo, protegida de la luz.
Para obtener resultados consistentes, es importante que las muestras se sequen completamente antes de continuar.
Después de que la placa esté completamente seca, use 200 microlitros de etanol al 95% para desalojar los pocillos. Luego deje el plato en la coctelera durante 30 minutos a 4 grados centígrados para evitar la evaporación. Después de 30 minutos, registre el OD540 en el lector de placas.