Un método para la preparación de muestras para visualizar bacterias formadoras de biopelículas en hifas fúngicas

Introduzca una colonia de hongos unida al celofán en una suspensión bacteriana marcada con fluorescencia. Retire el celofán e incube.

Las células bacterianas se adhieren a la superficie del hongo a través de moléculas y receptores de superficie. Las bacterias adheridas secretan sustancias poliméricas extracelulares que consisten en polisacáridos, proteínas y ADN, atrapando las células bacterianas y formando la base estructural de la biopelícula.

Enjuague la sección en una solución salina fuerte para eliminar las bacterias sueltas

En un tampón de fosfato, corte una sección de la colonia.

Transfiera la sección a agua estéril que contenga aglutinina de germen de trigo o WGA unida a un tinte rojo fluorescente.

WGA, una proteína vegetal, se une a los residuos de N-acetilglucosamina y ácido siálico, lo que permite que el tinte adherido emita fluorescencia en la pared celular del hongo.

Enjuague la sección en un tampón de fosfato.

Sumerja parcialmente una diapositiva en el búfer. Deja que la sección flote sobre él. Levante suavemente para que la sección se asiente sin interrumpir la biopelícula.

Coloque un medio de montaje, seguido de un cubreobjetos para el análisis microscópico.

Después de cultivar las bacterias durante la noche, centrifugue el cultivo a 5,000 veces g durante tres minutos y luego suspenda el sedimento en 25 mililitros de tampón estéril de fosfato de potasio 0.1 molar. Después de repetir la centrifugación, use el mismo tampón para ajustar la concentración bacteriana final a 10 a novenas células por mililitro.

Llene una microplaca de 6 pocillos con 5 mililitros de la suspensión bacteriana. Use una cuchilla de afeitar estéril para cortar la membrana de celofán del cultivo de hongos en cuadrados, con una sola colonia en cada membrana. Luego, con fórceps, retire con cuidado los cuadrados de celofán que contienen hifas del medio sólido y transfiéralos a pocillos individuales de la suspensión bacteriana.

Agite suavemente la microplaca hasta que las colonias de hongos se desprendan del celofán. Luego, retire las hojas de celofán dejando las colonias de hongos en la placa. Incubar la microplaca con agitación suave a 20 grados centígrados durante un tiempo dependiendo de las cepas utilizadas y de la etapa a analizar.

Para P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, incube los cultivos durante 30 minutos para obtener biopelículas en etapa temprana y hasta 16 horas para biopelículas maduras. Para eliminar las bacterias planctónicas y las bacterias adheridas electrostáticamente a las hifas, enjuague el hongo transfiriéndolo a una nueva microplaca de 6 pocillos llena de una solución salina fuerte. Agite suavemente el plato durante 1 minuto.

Transfiera el hongo a una nueva microplaca de 6 pocillos que contenga 5 mililitros de tampón estéril de fosfato de potasio 0,1 molares. Agite suavemente el plato durante dos minutos y luego transfiera el hongo a un tampón nuevo.

Mientras mantiene la colonia de hongos en amortiguador, use un bisturí para cortar la colonia aproximadamente por la mitad. Transfiera la mitad de la colonia a teñir a una placa de Petri que contenga 1 mililitro de agua estéril suplementada con un tinte fluorescente apropiado para visualizar la red fúngica, como la aglutinina de germen de trigo conjugada con Alexa Fluor633. Luego, incube la muestra en la oscuridad.

Después de la tinción, enjuague la muestra transfiriéndola a una tapa de placa de Petri que contenga 10 mililitros de tampón estéril de fosfato de potasio 0,1 molar y agite suavemente durante 1 minuto. Sumerja hasta la mitad un portaobjetos en la tapa de la placa de Petri y coloque delicadamente la sección cortada para que flote sobre el portaobjetos. A continuación, levante lentamente el lado de la solución tampón permitiendo que la muestra se asiente suavemente en el portaobjetos.

El aspecto más delicado es la posición de la muestra en el portaobjetos. Para evitar la interrupción de la biopelícula, la muestra y el portaobjetos deben sumergirse mientras se coloca la muestra, y la muestra no debe moverse más antes de la obtención de imágenes.

Finalmente, agregue 10 microlitros de medio de montaje antidecoloración a la muestra y cúbrala con un cubreobjetos de vidrio.