Análisis en tiempo real de la migración de células T residentes en diferentes regiones tumorales mediante microscopía confocal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:23 min • July 8th, 2025
Comience con un corte de tumor de pulmón que contenga células T residentes.
Las células T migran a través del microambiente tumoral e interactúan con las células tumorales y los elementos del estroma, realizando funciones inmunitarias.
La composición del microambiente tumoral influye fuertemente en el desplazamiento y la velocidad de las células T.
Agregue distintos anticuerpos acoplados fluorescentemente para marcar células T, células tumorales y elementos estromales en el microambiente.
Agregue DAPI, que infiltra células con una membrana plasmática dañada para teñir el núcleo, lo que permite la visualización de regiones necróticas dentro del tumor.
Observe la muestra teñida bajo un microscopio confocal.
Con una luz de fluorescencia adecuada, seleccione una región tumoral de interés que contenga células T residentes. Evaluar la viabilidad celular mediante la evaluación de células positivas para DAPI.
Para el análisis en tiempo real, defina intervalos de tiempo y tiempo total de grabación.
Para capturar imágenes de pila z, comience a una profundidad inferior a las células T etiquetadas y capture imágenes en varios intervalos de tiempo.
Utilice software de seguimiento para comparar la longitud del desplazamiento de las células T y la velocidad promedio en diferentes regiones tumorales.
Diluir los anticuerpos marcados con fluorescencia requeridos y el colorante nuclear de fluorescencia, DAPI, a las concentraciones finales requeridas en medio RPMI sin rojo de fenol. A continuación, retire la placa de cultivo de la incubadora y, con una punta fina, aspire el líquido dentro de las arandelas de acero inoxidable.
Ahora, sin tocar la rebanada, agregue 40 microlitros de los anticuerpos diluidos en cada rebanada tumoral. Para permitir la tinción, incube la placa a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Una vez completado el paso de tinción, con unas pinzas finas, retire las arandelas. Luego, saque suavemente las rodajas y sumérjalas en RPMI1640 medio sin rojo fenol durante 10 segundos. Vuelva a colocar las rodajas en los insertos de cultivo celular y agregue una gota de medio RPMI1640 sin rojo de fenol sobre cada rebanada. Incube la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego proceda a la obtención de imágenes.
Varias horas antes de comenzar este experimento, ajuste la temperatura de la cámara de calor del microscopio a 37 grados Celsius, luego, prepare el microscopio configurado para perfundir constantemente cortes tumorales con medio RPMI sin rojo de fenol oxigenado y para aspirar la solución a un matraz de recolección de desechos usando una bomba peristáltica.
Con la ayuda de pinzas finas, saque la rebanada manchada de la placa de seis pocillos y transfiérala a un plato de plástico de 35 milímetros lleno de medio RPMI sin rojo de fenol, luego, coloque un ancla de rebanada sobre la rebanada para sostenerla. A continuación, coloque esta placa de Petri en la platina de imágenes del microscopio.
Después de conectar las puntas de entrada y salida del sistema de perfusión, encienda la bomba peristáltica para permitir que el medio oxigenado pase a través de los tubos de perfusión. Baje el objetivo de inmersión en agua a la rebanada y concéntrese en la parte superior de la rebanada con luz de campo claro o con la longitud de onda adecuada.
Luego, usando los filtros apropiados, visualice y seleccione una región de interés que contenga todas las células de interés marcadas con fluorescencia, a saber, las células T CD8, los islotes tumorales y las células estromales positivas para CD90. Configure una sesión de imágenes utilizando la intensidad del láser y los tiempos de exposición adecuados para adaptarse al brillo de las señales fluorescentes observadas. Luego, configure el grosor de la pila Z para obtener imágenes dentro del corte del tumor.
A continuación, seleccione el intervalo de tiempo de la imagen de la pila Z y el tiempo total de grabación para capturar imágenes en intervalos de tiempo específicos. Después de capturar y exportar las imágenes fluorescentes, analice la migración de células T CD8 como se describe en el protocolo de texto.
Descripción general
Este estudio investiga la dinámica de la migración de linfocitos T dentro de secciones de tumor pulmonar, centrándose en sus interacciones con las células tumorales y el microambiente circundante. La metodología implica el etiquetado fluorescente y la microscopía confocal para visualizar el comportamiento de los linfocitos T en tiempo real.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Oncología
- Biología celular
Antecedentes
- Los linfocitos T desempeñan un papel crucial en la respuesta inmunitaria contra los tumores.
- El microambiente tumoral afecta significativamente el comportamiento de los linfocitos T.
- Comprender la dinámica de los linfocitos T puede orientar las estrategias de inmunoterapia contra el cáncer.
- La marcación fluorescente permite la observación detallada de las interacciones celulares.
Objetivo del estudio
- Analizar los patrones de migración de linfocitos T dentro de tumores pulmonares.
- Evaluar el impacto del microambiente tumoral sobre el desplazamiento y la velocidad de los linfocitos T.
- Utilizar técnicas de imagen avanzadas para la observación en tiempo real.
Métodos Utilizados
- Preparación de cortes de tumor pulmonar con linfocitos T residentes.
- Etiquetado fluorescente de linfocitos T, células tumorales y elementos estromales.
- Microscopía confocal para la obtención de imágenes y análisis de la dinámica celular.
- Software de seguimiento para evaluar el desplazamiento y la velocidad de los linfocitos T.
Resultados principales
- La imagen en tiempo real reveló patrones de migración distintos de los linfocitos T.
- El microambiente tumoral influyó en la velocidad y el desplazamiento de los linfocitos T.
- El marcado fluorescente resaltó de manera efectiva las regiones necróticas y las interacciones celulares.
- El análisis de datos proporcionó información sobre el comportamiento de los linfocitos T en diferentes regiones del tumor.
Conclusiones
- El estudio mejora la comprensión de la dinámica de las células T en tumores pulmonares.
- Los hallazgos podrían contribuir al desarrollo de inmunoterapias dirigidas.
- Las técnicas de imagen en tiempo real son valiosas para estudiar las respuestas inmunitarias en tumores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La obtención de imágenes confocales en tiempo real de la migración de linfocitos T CD8 residentes en secciones de tumor pulmonar humano proporciona información útil sobre la dinámica de las células inmunitarias dentro del microambiente tumoral. Esta capacidad permite la desestimación mecanicista y la validación de objetivos para programas de inmuno-oncología, apoyando la confianza predictiva en la interfaz de descubrimiento y traslación. Métricas cuantitativas de migración orientan las decisiones del portafolio al aclarar el compromiso inmunitario y las barreras microambientales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de las interacciones entre linfocitos T y tumores, y entre linfocitos T y estroma, in situ.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación del desplazamiento y la velocidad de las células inmunitarias.
- Proporciona una reducción mecanicista de riesgos para objetivos inmunomoduladores dentro de contextos tisulares complejos.
- Facilita una mayor confianza predictiva en las hipótesis sobre la participación inmunitaria.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece sistemas validados de rebanadas tumorales ex vivo para ensayos posteriores de migración de células inmunitarias.
- Proporciona lecturas cuantitativas reproducibles de la motilidad de linfocitos T en diferentes regiones tumorales.
- Permite la estandarización de flujos de trabajo de imagen y análisis para el seguimiento de células inmunitarias.
- Facilita la selección de compuestos o biológicos que modulan la migración de células inmunitarias.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea las métricas de migración de células inmunitarias con microentornos tumorales humanos relevantes para la enfermedad.
- Conecta los hallazgos del descubrimiento con la validación preclínica al mantener la arquitectura tisular y la heterogeneidad.
- Proporciona información para el avance ajustado al riesgo de activos en inmuno-oncología basado en lecturas funcionales del sistema inmunitario.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales para la infiltración y actividad de células inmunitarias.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este flujo de trabajo de imagen y análisis integra desde el descubrimiento inicial hasta la investigación traslacional, permitiendo pruebas iterativas de hipótesis y reducción del riesgo mecanicista en las líneas de investigación de inmuno-oncología.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la migración de linfocitos T y su interacción con compartimentos tumorales y estromales para aclarar vías biológicas.
- Selección: Proporciona ensayos cuantitativos estandarizados de migración para moduladores de células inmunitarias.
- Análisis: Genera métricas de desplazamiento y velocidad para comparaciones estadísticas rigurosas entre distintas regiones tumorales.
- Investigación Traducional: Mantiene el contexto del tejido humano para garantizar continuidad preclínica y alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable ex vivo para estudios de migración de células inmunitarias en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el direccionamiento de células inmunitarias.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados y reproducibles de imagen y análisis para estudios de migración inmunitaria.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y la asignación de capital al aclarar el compromiso inmunitario en tejido tumoral humano.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de activos en inmuno-oncología basada en métricas inmunitarias funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal y manejo de tejidos vivos.
- Exige acceso a plataformas de imagen avanzadas y software de seguimiento.
- Necesita estandarización entre equipos de los protocolos de tinción, adquisición de imágenes y análisis.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes tipos de tumores o poblaciones de células inmunitarias.
- La viabilidad y la calidad del tejido pueden limitar la reproducibilidad y la interpretación del ensayo.
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Última actualización: 29 agosto 2026