Una técnica de citometría de flujo FRET para detectar la agregación de proteínas reporteras inducida por semillas de tau

Tome un cultivo de células de mamíferos que exprese el dominio repetido de la proteína tau de unión a microtúbulos.

Estos reporteros tau citoplasmáticos poseen una mutación propensa a la agregación y existen como monómeros.

Los reporteros se fusionan con el fluoróforo A o B, y el espectro de emisión del primero se superpone con el espectro de absorción del segundo.

Agregue un liposoma complejado con semillas de tau o agregados fibrilares de tau de longitud completa.

Al ingresar a la célula, el liposoma libera las semillas en el citoplasma.

Las semillas liberadas median la agregación de los reporteros tau, lo que acerca al fluoróforo A al fluoróforo B.

Agregue tripsina para separar las células, luego realice la fijación.

Analice las células con un citómetro de flujo.

Debido a la proximidad dentro del agregado, tras la excitación, la transferencia de energía del fluoróforo A al B a través de una interacción dipolo-dipolo se denomina transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o FRET.

El fluoróforo B excitado emite una señal FRET, cuya presencia indica agregación de proteínas.

Para volver a colocar las células biosensoras en condiciones estériles, enjuague cada línea celular con PBS tibio seguido de una incubación de 3 minutos con tripsina-EDTA. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con medio de cultivo tibio e inmediatamente transfiera las células a un tubo cónico.

Centrifugar las células, resuspendiendo el pellet en medio fresco. Luego, cuente las células y haga una dilución celular de mezcla maestra de 3,500,000 células por 13 mililitros de medio. Con una pipeta multicanal, transfiera lentamente 130 microlitros de las células a cada pocillo de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejido de fondo plano, teniendo cuidado de colocar las puntas de la pipeta en el centro de los pocillos sin tocar el fondo de la placa.

Una vez que las células se hayan colocado, déjelas reposar, sin tocarlas durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono y mayor o igual al 80% de humedad relativa. Al día siguiente, cuando las células biosensoras sean confluentes entre un 60% y un 65%, combine el medio sérico reducido, el reactivo liposomal y la fuente de semillas biológicas para hacer complejos de transducción.

Luego, pipetee suavemente 20 microlitros de complejo de transducción por el costado de cada pocillo biosensor individual y devuelva las células tratadas a la incubadora durante otras 24 a 48 horas. Antes de la recolección, las células no tratadas mostrarán solo fluorescencia difusa. Sin embargo, las células tratadas con material de semilla de tau mostrarán agregados brillantes después de 1 a 2 días.

Para cosechar las células, reemplace el medio de cultivo celular con 50 microlitros de tripsina-EDTA, deteniendo la reacción después de 5 minutos con 150 microlitros de medio de cultivo enfriado. Inmediatamente, transfiera las células a una placa de fondo redondo de 96 pocillos y granular las células. Aspire el sobrenadante sin alterar los gránulos y luego vuelva a suspender las células en 50 microlitros de paraformaldehído al 2% durante 10 minutos. Luego, vuelva a girar las células y vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de tampón de citometría de flujo enfriado.