JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:37 min • July 8th, 2025
Tratar cultivos neuronales con concentraciones crecientes de una toxina de prueba.
La toxina ingresa a las células y se libera en el citosol.
Dependiendo de su potencial, la toxina puede prevenir la fusión vesicular, inhibiendo la liberación de neurotransmisores.
Reemplace el medio con un tampón que contenga compuestos neurofarmacológicos específicos para bloquear los potenciales de acción neuronales.
Coloque la placa de cultivo en una etapa de electrofisiología. Para comenzar a grabar, conecte un soma neuronal con una pipeta que contenga un electrodo de registro.
Aplique presión negativa constante para aspirar una pequeña porción de membrana, formando un gigaseal, un sello hermético que garantiza una interferencia mínima durante la grabación.
Mantenga un voltaje de membrana constante para medir las corrientes neuronales.
Aplicar pulsos de presión negativa para romper la membrana, estableciendo contacto directo entre la neurona y la pipeta.
Registre las corrientes producidas en la neurona debido a la captación de neurotransmisores, denominados mEPSC.
Una disminución en la frecuencia de mEPSC con una mayor exposición a toxinas indica la inhibición de la liberación de neurotransmisores.
Diluir la neurotoxina botulínica serotipo A a 100 veces la concentración final deseada en medio de cultivo ESN y calentar a 37 grados centígrados. Luego, agregue un volumen apropiado de toxina a los cultivos DIV 21+ ESN. Agite la placa de cultivo y regrese a la incubadora.
En el momento deseado, aspire el medio de cultivo ESN y lave dos veces con tampón de registro extracelular o ERB. Luego, agregue 4 mililitros de ERB suplementados con 5 tetrodotoxina micromolar para bloquear los potenciales de acción y 10 bicuculina micromolar para antagonizar la actividad del receptorGABA A. A continuación, transfiera el plato al equipo de electrofisiología. No se requiere perfusión ni control de temperatura para la inhibición medida de la transmisión sináptica o el ensayo MIST.
Después de usar un extractor de micropipetas para tirar de pipetas de borosilicato con 5 a 10 megaohmios de resistencia, rellene una pipeta con tampón de registro intracelular. A continuación, sumerja suavemente la pipeta en reactivo siliconante. Asegure la pipeta de grabación en el soporte del electrodo y conecte una jeringa llena de aire al tubo que se introduce en el soporte del electrodo. Proporcione una presión positiva constante a través de la jeringa mientras baja la pipeta de registro en el ERB.
Después de aterrizar suavemente la pipeta de registro en el soma de la neurona que se va a registrar, tome la presión positiva rompiendo el sello de la jeringa. Vuelva a conectar la jeringa y aplique una presión negativa sostenida a través de una suave inspiración para formar un sello de gigaohmio. Una vez que se forma el sello de gigaohmios, disminuya el voltaje de retención a menos 70 milivoltios, luego aplique con cuidado pulsos cortos de presión negativa con la jeringa para entrar en la configuración mayorista.
Monitoree los picos de capacitancia durante 30 segundos para confirmar que el parche es estable. Cancele los picos de capacitancia en el software de piratas informáticos y cambie al modo de pinza amperimétrica para monitorear y registrar el potencial de membrana en reposo. Sin ajuste para los potenciales de unión líquidos, el potencial de membrana en reposo debe estar entre menos 67 y menos 82 milivoltios.
Ajuste la ganancia a 2 milivoltios por picoamperio. Cambie al modo de pinza de voltaje y realice un continuo menos 70 milivoltios, registrando durante 3 a 5 minutos para detectar corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura.
Analice de 3 a 5 minutos de datos registrados para detectar MEPSC utilizando la configuración predeterminada para EPSC del receptor AMPA en minianálisis. Recopile y guarde información sobre los eventos detectados. Después de recolectar frecuencias de mEPSC para 8 a 12 controles y de 8 a 12 muestras tratadas con neurotoxina botulínica para cada condición de exposición, analice la frecuencia contra la edad y los controles emparejados por lote.