Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:22 min. • July 8th, 2025
Comience con un tubo que contenga vectores separados para los genes de anticuerpos de cadena pesada y cadena ligera.
Agregue un reactivo de transfección para formar complejos con los vectores.
Transfiera esta mezcla a células huésped de mamíferos e incube para su internalización.
Agregue un agente antiaglutinante para promover la distribución uniforme de las células transfectadas, mejorando la recuperación y el crecimiento celular.
Agregue una solución antibacteriana y antimicótica para evitar la contaminación.
Dentro de la célula huésped, los vectores se integran en el genoma del huésped.
Después de la transcripción de genes, los ARNm individuales salen del núcleo y se someten a traducción para formar cadenas de anticuerpos nacientes.
El plegado y la modificación adecuados de las cadenas nacientes producen cadenas pesadas y ligeras.
Estas cadenas se combinan para formar anticuerpos completamente funcionales, que luego se liberan en el medio extracelular.
Coseche el medio y centrifuge. Filtra el sobrenadante.
Pasar el filtrado a través de una columna de purificación que permite la unión selectiva de los anticuerpos.
Usando un tampón de elución, eluya los anticuerpos purificados.
Cultive células CHO en 200 mililitros de medios en largos matraces deflectores Erlenmeyer. Combine 5 mililitros de medios CHO freestyle con 50 microgramos de ADN de clon pesado variable y 75 microgramos de ADN de clon ligero variable en un tubo de 15 mililitros. Luego, agita el tubo. Deje la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Agregue 750 microlitros de 1 miligramo por mililitro de stock de polietileno amina a la solución de ADN y agite agresivamente durante 30 segundos.
Deje la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos más. Agregue toda la mezcla a las celdas CHO mientras agita manualmente el matraz. Incube inmediatamente las células a 37 grados centígrados mientras agita a 130 RPM.
Al día siguiente, agregue 2 mililitros de agente antiaglutinante 100x y 2 mililitros de solución antimicótica antibacteriana 100x a las células. Incube los matraces a 32 a 34 grados Celsius agitando a 130 RPM. Continúe cultivando las células durante 10 a 11 días, agregando 10 mililitros de alimento de triptona N1 y 2 mililitros de suplemento de glutamina 100x cada cinco días. Cuente las células cada tres días para asegurarse de que la viabilidad celular se mantenga por encima del 80%. El día 10 u 11, coseche el medio para la purificación de anticuerpos centrifugando el cultivo a 3.000 veces g y 4 grados centígrados durante 40 a 60 minutos. Luego, filtre el medio transparente con un filtro de botella de 0.22 micrómetros.
Para purificar los anticuerpos, equilibre la columna de proteína A con dos volúmenes de columna de tampón de unión. Pase el medio filtrado a través de la columna a un caudal de 1 mililitro por minuto. Luego lave la columna con dos volúmenes de columna de tampón de unión. Use 5 mililitros de tampón de elución para eluir el anticuerpo en fracciones de 500 microlitros.