Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:03 min. • July 8th, 2025
Tome diluciones en serie de un anticuerpo dirigido a la hemaglutinina del virus de la influenza, o HA, una glicoproteína que consiste en una cabeza globular y un tallo.
Agregue las diluciones a células de mamíferos transfectadas que expresan HA unido a la superficie. Los anticuerpos se unen a las regiones del tallo de HA, formando complejos inmunes.
Introducir células T modificadas que expresan receptores Fc y codifican un reportero de luciferasa bajo el control del factor de transcripción NFAT.
Durante la incubación, el anticuerpo unido a HA se une al receptor Fc, mientras que la cabeza de HA se une al ácido siálico, desencadenando la activación de las células T y aumentando la concentración de calcio citosólico.
Esta activación inicia una cascada de señalización que da como resultado la desfosforilación de NFAT, desencadenando su translocación nuclear.
NFAT se une a sus elementos de respuesta en el genoma, impulsando la expresión de luciferasa.
Agregue un sustrato bioluminiscente permeable a las células. La luciferasa oxida el sustrato, produciendo una señal.
La disminución de la luminiscencia con la disminución de la concentración de anticuerpos confirma la activación de las células T mediadas por anticuerpos específicos del tallo de HA.
Para evaluar la capacidad de anticuerpos específicos de interés para atacar las células que expresan hemaglutinina, reemplace el sobrenadante de los cultivos celulares infectados viralmente con 25 microlitros de medio de ensayo de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, o ADCC.
A continuación, en una placa separada de 96 pocillos, realice diluciones de 4 veces de los anticuerpos de interés en medio ADCC por triplicado y fresco a partir de 10 microgramos por mililitro según el esquema, y teniendo cuidado de incluir los controles de fondo y sin anticuerpos.
Cuando se haya diluido todo el anticuerpo, transfiera 25 microlitros del anticuerpo diluido a los pocillos correspondientes apropiados en la placa celular experimental y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. Después de 15 minutos, agregue 7,5 veces 10 a la 4ª célula efectora modificada de Jurkat, expresando el receptor Fc apropiado por pocillo en 25 microlitros de medio ADCC para un volumen final de 75 microlitros de medio ADCC por pocillo.
Regrese la placa a la incubadora de cultivo celular durante 6 horas, descongelando el tampón de sustrato de luciferasa en un baño de agua a 37 grados Celsius durante la última hora de incubación. Cuando el tampón esté listo, agregue 75 microlitros de tampón de sustrato de luciferasa a todos los pocillos excepto al pozo de control de fondo, y lea la placa en un luminómetro. A continuación, se puede calcular la inducción del pliegue de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos en los cultivos celulares transfectados o infectados.