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Inmunología
0 vistas • 2:10 min • July 8th, 2025
Prepare una mezcla de transfección agregando un polímero catiónico apropiado y vectores plásmidos separados para genes de anticuerpos de cadena pesada y cadena ligera.
El polímero cargado positivamente se une a los plásmidos cargados negativamente, formando complejos.
Agregue esta mezcla de transfección a una placa de múltiples pocillos que contenga cultivo de células renales embrionarias humanas en un medio sin suero e incube.
Los complejos ingresan a las células a través de la endocitosis, causando hinchazón y ruptura endosómica, liberándolos en el citoplasma.
El polímero catiónico produce poros en la membrana nuclear, lo que facilita la entrada de vectores y permite su transcripción, seguida de la traducción en proteínas de cadena pesada y ligera.
Estas proteínas se mueven al retículo endoplásmico, donde las proteínas de cadena pesada y ligera se dimerizan y se unen covalentemente mediante enlaces disulfuro, formando anticuerpos.
Los anticuerpos viajan al aparato de Golgi para modificaciones postraduccionales adicionales y se empaquetan en vesículas para su liberación extracelular.
Recolecte el medio que contiene los anticuerpos liberados. Agregue un medio sin suero para la generación continua de anticuerpos.
Prepare las células HEK en DMEM suplementado y hágalas crecer hasta una confluencia del 75% en matraces de cultivo de 75 centímetros cuadrados. Para cada transfección de cadena pesada/ligera, prepare una mezcla con 1,75 mililitros de DMEM sin suero. Incluya 4,5 microgramos de vector de cadena pesada, 3 microgramos de vector de cadena ligera y 50 microlitros de solución de polietilenimina. Agregue suavemente esta mezcla a una placa de celdas HEK y agite la solución sobre la placa.
Incube la placa durante la noche y luego comience a recolectar los medios de cultivo todos los días, reemplazándolos con un medio sin suero. El medio contiene los anticuerpos y se puede recolectar diariamente durante cuatro días.