Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:32 min. • July 8th, 2025
Tome una suspensión de células asesinas naturales o NK.
Agregue anticuerpos monoclonales anti-CD20 e incube.
En ausencia de células cancerosas diana que expresen el antígeno CD20, la región Fc de los anticuerpos se une a los receptores FcγRIIIa en la superficie de las células NK.
Después de la incubación, agregue medios refrigerados. Centrifugar y eliminar los anticuerpos no unidos.
A continuación, agregue anticuerpos de cadena ligera κ antihumanos. Incubar.
Estos anticuerpos secundarios se unen a la cadena ligera κ de los anticuerpos monoclonales.
La reticulación de anticuerpos imita la unión del antígeno diana, desencadenando una cascada de señalización intracelular.
Esto provoca una estimulación artificial de las células NK en ausencia de células cancerosas.
Las células NK activadas experimentan un reordenamiento citoesquelético y liberan gránulos citotóxicos.
Además, las células producen quimiocinas y citocinas.
Después de la duración deseada, agregue medios enfriados para detener la estimulación celular.
Centrifugar el tubo. Recoja el sobrenadante y el sedimento celular para el análisis posterior de las funciones de las células NK efectoras mediadas por anticuerpos.
Dispense 100 microlitros de células asesinas naturales resuspendidas en tubos de 1,5 mililitros o en una placa de fondo en U de 96 pocillos, y coloque las células en hielo. Prepare rituximab u otro anticuerpo de interés a una concentración de 100 microgramos por mililitro.
Agregue 1 microlitro a cada tubo de células para obtener una concentración final de 1 microgramo por mililitro e incube las células en hielo durante 30 minutos. Durante la incubación, prepare una solución de anticuerpo de cadena ligera kappa antihumano en un medio a una concentración de 50 microgramos por mililitro. La cantidad de solución de anticuerpos necesaria será de 50 microlitros por muestra celular.
Caliente la solución de anticuerpos a 37 grados centígrados en un bloque de calor o en un baño de agua. Cuando se complete la incubación de las células, agregue 1 mililitro de medio helado a cada tubo y centrifugue las células a 135 veces g y 4 grados Celsius durante 5 minutos. Lave las celdas nuevamente con 1 mililitro de medio helado. Aspirar el sobrenadante después del último lavado y añadir 50 microlitros de la solución de anticuerpos anti-cadena ligera kappa humano para activar las células. Coloque inmediatamente muestras de células a 37 grados centígrados en un bloque de calor o en un baño de agua e incube hasta los puntos de tiempo deseados para el análisis u otros procedimientos.
La mejor manera de manejar múltiples muestras es usar una rejilla flotante en un baño de agua a 37 grados, que se puede quitar y colocar sobre hielo para detener todas las reacciones de inmediato.