Una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno

Tomemos vectores de expresión eucariotas, que codifican una cadena pesada de anticuerpos o una cadena ligera de anticuerpos, clonados a partir de células B específicas de antígeno.

Introducir polietilenimina, un polímero catiónico, que interactúa electrostáticamente con los vectores cargados negativamente, formando poliplexos.

Incubar células de mamíferos con los poliplexos, que se adhieren a las células y se internalizan mediante endocitosis. Los endosomas resultantes se fusionan con los lisosomas.

Los polímeros en los poliplex causan hinchazón osmótica de la vesícula, lo que lleva a su ruptura y liberación de los vectores.

Los vectores liberados ingresan al núcleo y se transcriben en ARNm de cadena pesada y cadena ligera, que se traducen a través de ribosomas en el retículo endoplásmico.

Las cadenas peptídicas resultantes se ensamblan en anticuerpos, que se transportan al Golgi y se empaquetan en vesículas secretoras.

Tras la fusión de las vesículas secretoras y la membrana celular, los anticuerpos se liberan extracelularmente.

Coseche el sobrenadante que contiene anticuerpos para ensayos posteriores.

Siembre 15,000 células renales embrionarias humanas en 200 microlitros de Eagle Medium modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano, un día antes de la transfección. Luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante la noche al 5% de dióxido de carbono. Cotransfecte las células utilizando un reactivo de transfección derivado lineal de polietilenoina. Diluir 0,5 microlitros de reactivo de transfección de ADN con 10 microlitros de 150 milimolares de cloruro de sodio.

A continuación, diluya 0,125 microgramos de cada vector variable que exprese cadenas pesadas y ligeras en 10 microlitros de cloruro de sodio de 150 milimolar. Agite todas las diluciones durante 10 segundos cada una. Luego, mezcle el reactivo de transfección de ADN previamente diluido con 10 microlitros de solución de ADN. Agite rápidamente la mezcla de transfección de ADN durante 15 segundos e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Agregue la mezcla de transfección de ADN gota a gota sobre las células y luego, gire suavemente la placa. Reemplace el medio 16 horas después de la transfección y cultive las células durante cinco días en medio sin suero a 37 grados centígrados.