Un ensayo para detectar autoanticuerpos en suero humano utilizando un cultivo neuronal del hipocampo

Tomemos el hipocampo embrionario de rata.

Agrega tripsina. Incubar para mediar la descomposición de la matriz tisular, aflojando las células del hipocampo.

Diluir con un tampón. Incubar para una digestión enzimática continua con tripsina.

A continuación, transfiera la masa de tejido a un tubo que contenga medios. Pipetear repetidamente para la disociación mecánica en células individuales.

Células de semillas en cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina dentro de placas de cultivo.

incubar. Las células del hipocampo se adhieren a las superficies recubiertas. Las neuronas desarrollan una laminilla y extienden neuritas menores.

Además, las neuritas crecen con procesos axonales y dendríticos, formando una red neuronal.

Las neuronas maduras expresan receptores excitadores sinápticos, receptores de N-metil -D-aspartato o NMDAR.

Después de la incubación, lave los cubreobjetos con medios.

Agregue un suero diluido para pacientes con encefalitis autoinmune. Los autoanticuerpos se unen a los NMDAR neuronales.

Lavar con tampón y luego arreglar las celdas.

Agregue anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo que se unan a los autoanticuerpos unidos a NMDAR.

Lavar con tampón. Coloque el cubreobjetos sobre los medios de montaje que contienen DAPI para teñir los núcleos.

Observe microscópicamente las señales de fluorescencia en las neuronas, lo que indica la presencia de autoanticuerpos en el suero.

Para la disociación enzimática del hipocampo a 1 mililitro de tripsina al 2,5% en el tubo de 50 mililitros que contiene el hipocampo, después de llevar el volumen en el tubo a 5 mililitros con HBSS, incube el tubo durante 15 minutos en el baño de agua a 37 grados centígrados. Para diluir aún más la tripsina, agregue 10 mililitros de HBSS precalentado y vuelva a colocar el tubo en el baño de agua a 37 grados centígrados durante 5 minutos.

A continuación, use una micropipeta de 1,000 microlitros para transferir el hipocampo que aparece como una masa mucosa a un tubo de 50 mililitros e incube el tejido con 6 mililitros de HBSS precalentado durante 5 minutos, como se demostró. Para disociar el tejido mecánicamente, transfiera la masa del hipocampo a un tubo de 2 mililitros con fondo cónico. Después de agregar 1 mililitro de medio DMEM precalentado, homogeneice el gránulo con una micropipeta de 1.000 microlitros aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo.

Asegurándose de no crear burbujas, repita la aspiración hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces con una pipeta de vidrio previamente estirada, con la punta en contacto con el fondo cónico del tubo, hasta que la mezcla esté translúcida. Cuente las células antes de distribuirlas uniformemente en un plato de 3,5 centímetros con movimientos cruzados y agitadores. Una vez hecho esto, coloque el plato en la incubadora con dióxido de carbono al 5%.

Para la inmunotinción fluorescente de células in vitro de 14 días, agregue la muestra que contiene anticuerpos anti-NMDAR a los cubreobjetos e incube a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5%. Después de una hora, tratar la muestra con formaldehído al 4% en PBS, como solución de fijación, a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego lave la muestra tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, seguido de la adición de anticuerpo secundario anti-cabra antihumano Alexa Fluor 488 a 1,000 diluciones durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, monte los cubreobjetos que contienen la muestra con un medio de montaje líquido y aspire el líquido restante.