Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 5:01 min. • July 8th, 2025
Tome suero humano diluido en serie e inactivado por calor que contenga virus respiratorio sincitial o anticuerpos neutralizantes específicos del VRS.
Agrega la suspensión viral. Los anticuerpos neutralizan los virus de una manera dependiente de la dilución.
Introduzca la mezcla en las monocapas de células epiteliales humanas e incube para la adsorción viral.
Deseche la mezcla. Agregue medios que contengan carboximetilcelulosa, formando una capa semisólida. Incubar.
El VRS utiliza la maquinaria de la célula huésped para sintetizar ARN viral y proteínas, que posteriormente se ensamblan y brotan como viriones individuales.
Las células infectadas eventualmente mueren. La carboximetilcelulosa restringe el movimiento del virus, causando infección localizada y muerte celular, formando placas.
Elimina la superposición.
Fije las células con un tampón que contenga acetona. Introduzca un tampón de bloqueo que contenga detergente para permeabilizar las células y evitar interacciones de anticuerpos no específicas.
Agregue anticuerpos primarios dirigidos a las proteínas virales.
Superposición con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos dirigidos a los anticuerpos primarios.
Tome imágenes de los pocillos para cuantificar las placas fluorescentes.
La dilución sérica más alta neutralizando el cincuenta por ciento del VRS representa el título de neutralización.
Antes de la inoculación de células A549 con VRS, examine la placa celular bajo un microscopio óptico para confirmar que las monocapas de células A549 son confluentes en un 80%. Luego, invierta la placa suavemente para desechar el medio y seque ligeramente la placa sobre una toalla de papel estéril y absorbente. Después de cada lavado con PBS filtrado y estéril.
A continuación, agregue 100 microlitros por pocillo de la mezcla de virus y suero a los pocillos correspondientes en la placa celular A549 de acuerdo con la plantilla de placa proporcionada en el manuscrito, e incube la placa a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5% durante una hora. Al final de la incubación, use una pipeta para eliminar 90 microlitros por pocillo y agregue 100 microlitros del medio que contiene 1X M 199, CMC al 1,5% y FCS al 2% y mezcla de penicilina y estreptomicina. Incube la placa a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante tres días.
Para fijar y desarrollar una placa de ensayo, primero invierta suavemente la placa celular A549 infectada con VRS para desechar el medio que contiene M 199, CMC, FCS al 2% y mezcla de penicilina y estreptomicina. Luego, agregue lentamente 200 microlitros del tampón de fijación a cada pocillo. Incube la placa a menos 20 grados centígrados durante 20 minutos. Luego, deseche el tampón de fijación y seque suavemente una toalla de papel absorbente.
Deje secar el plato boca abajo durante 10 minutos. Luego, con tampón PBS filtrado que contenga 0.05 polisorbato-20, prepare una solución bloqueadora de leche al 5%. Agregue 200 microlitros de la solución de bloqueo a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al final de la incubación, invierta la placa suavemente para desechar la solución y seque con una toalla de papel absorbente.
Para producir el anticuerpo primario, diluya de 1 a 500 anticuerpos contra el VRS de cabra X en la solución de bloqueo. Agregue 50 microlitros a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante una hora. Lave la placa tres veces con polisorbato PBS filtrado.
A continuación, produzca el anticuerpo secundario diluyendo de 1 a 5,000 inmunoglobulina G anti-cabra AlexaFluor Donkey en la solución de bloqueo. Agregue 50 microlitros a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante una hora. Lave la placa cinco veces con polisorbato PBS filtrado.
Para contar placas con un lector de manchas automático, primero, use una placa de cultivo de 96 pocillos sin usar para calibrar el instrumento ingresando la configuración de conteo en el canal FITC. Luego, lea la placa de la celda, envuélvala en papel de aluminio y guárdela a 4 grados centígrados. A continuación, verifique las imágenes de los pocillos en busca de placas artefactuales o monocapas celulares alteradas, y excluya los pocillos con monocapas celulares rotas.