Detección de autoanticuerpos de islotes humanos mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia

Para detectar autoanticuerpos de islotes, un biomarcador de la diabetes tipo 1, tome muestras de suero humano y agregue ácido acético para inhibir los componentes que interfieren.

Incube y luego agregue un tampón alcalino para neutralizar el ácido.

Transfiera el suero tratado a una placa de pocillos múltiples que contenga una mezcla de autoantígenos de islotes humanos, incluidos los antígenos de captura biotinilados y conjugados con rutenio, cada uno a una concentración óptima para el ensayo.

El autoanticuerpo de los islotes en la muestra positiva une el antígeno conjugado con rutenio al antígeno de captura biotinilado, formando un complejo antígeno-anticuerpo.

Transfiera la mezcla a una placa de electroquimioluminiscencia recubierta de estreptavidina pretratada con un agente bloqueador y equipada con electrodos de trabajo y contraelectrodos.

Incubar para permitir interacciones complejas biotiniladas con la estreptavidina unida y luego lavar.

Agregue un tampón que contenga tripropilamina o TPA.

En un instrumento de electroquimioluminiscencia, la aplicación de voltaje entre los electrodos inicia la oxidación del rutenio y el TPA, generando radicales TPA.

Los radicales TPA excitan complejos de rutenio, que emiten fotones mientras regresan a su estado fundamental.

Una alta quimioluminiscencia en la muestra positiva indica la presencia de autoanticuerpos de los islotes.

Mezcle el autoantígeno de los islotes humanos con biotina o sulfo-tag en una proporción molar de 1:5 en un tubo y cubra el tubo con papel de aluminio, ya que ambas etiquetas son sensibles a la luz. Luego, incube el tubo durante una hora a temperatura ambiente. Mientras tanto, cuando la incubación esté en marcha, cebe la columna de centrifugación con solución salina doble tamponada con fosfato.

Luego, centrifuga la columna a 1,000 veces g durante dos minutos cada vez. A continuación, centrifuga la mezcla de etiquetas de autoantígenos en la columna de centrifugado a 1.000 veces g durante 2 minutos. Luego, alícuota y almacene ese antígeno etiquetado a 80 grados Celsius negativos.

A continuación, use la concentración racional del antígeno marcado con biotina etiquetada con sulfoetiqueta según el ensayo de tablero de ajedrez para el tampón de antígeno para preparar 3 mililitros de solución de antígeno por placa de 96 pocillos.

Luego, en cada pocillo, agregue 4 microlitros de suero y ajuste el volumen final a 20 microlitros con solución salina tamponada con fosfato 1 veces. Luego, agregue 20 microlitros de solución de antígeno marcada en cada pocillo y cubra la placa con papel de aluminio sellador para evitar la luz. Luego, transfiera el plato a una coctelera a temperatura ambiente durante 2 horas.

Una vez que la coctelera se detenga, deje el plato a 4 grados centígrados en el refrigerador durante 18 a 24 horas. Ahora, mezcle 15 microlitros de suero con 18 microlitros de ácido acético 0,5 molar para cada muestra, e incube el mismo a temperatura ambiente durante 45 minutos.

Sobre la base del ensayo de tablero de ajedrez, utilice la concentración racional del antígeno marcado con biotina marcada con sulfoetiqueta para preparar la solución de antígeno.

Luego, alícuota 35 microlitros del tampón de antígeno en cada pocillo de una nueva placa de PCR. Justo antes de que se complete el coro de incubación de la mezcla de suero, agregue 3,8 microlitros de tampón Tris molar a pH nueve a lo largo del lado de cada pocillo en la placa de antígenos.

Una vez finalizada la incubación, transfiera rápidamente 25 microlitros del suero tratado con ácido acético en cada pocillo de la placa de antígenos y agite la solución. Luego, cubra la placa de PCR con papel de sellado para evitar la luz y colóquela en una coctelera a temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez hecho esto, transfiera el plato a 4 grados centígrados en el refrigerador e incube durante 18 a 24 horas.

Retire la placa de estreptavidina del refrigerador a 4 grados centígrados y deje que la placa alcance la temperatura ambiente. Después de que la placa de estreptavidina alcance la temperatura ambiente, agregue 150 microlitros de bloqueador A al 3% en cada pocillo, cubra la placa de PCR con papel de sellado e incube en el refrigerador durante la noche.

Al día siguiente, retire la placa de estreptavidina del refrigerador y expulse el tampón de los pocillos. Luego, seque el plato colocándolo boca abajo sobre algunas toallas de papel secas para que el tampón restante se empape. Luego, agregue 150 microlitros de tampón PBST de 1 pliegue para lavar el pozo durante tres lavados consecutivos.

A continuación, transfiera 30 microlitros de antígeno sérico incubado en cada pocillo de la placa de estreptavidina y cubra la placa con papel de aluminio para evitar la luz. Luego, transfiera el plato a una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Después de una hora, deseche la incubadora de antígenos séricos de la placa y agregue 150 microlitros de tampón PBST de 1 vez para lavar el pocillo tres veces. Una vez finalizado el lavado, agregue 150 microlitros de tampón de lectura a cada pocillo para leer en un lector de placas.