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Comience con una placa de cultivo que contenga criosecciones de yeyuno de ratón rellenas de gelatina fijadas en formol con células de mechón con microvellosidades apicales y soma en forma de carrete.
Lavar con un tampón que contenga detergente para permeabilizar las membranas celulares.
Agregue una solución alcalina de recuperación de antígenos. Incubar para romper los enlaces cruzados de proteínas inducidos por la fijación, revelando las proteínas para la tinción.
Aplique una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Superposición con anticuerpos primarios dirigidos a una proteína de unión a actina, específicamente fosforilada en células de mechón.
Eliminar los anticuerpos no unidos. Introduzca una mezcla de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo, colorante de unión al ADN y conjugado de colorante fluorescente de faloidina.
Los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos primarios, el conjugado de colorante fluorescente faloidina marca la actina y el colorante de unión al ADN marca los núcleos celulares.
Retire los componentes no unidos y agregue un tampón sin detergente.
Transfiera la sección a un portaobjetos de vidrio recubierto con adhesivo, montándolo con un soporte.
Bajo un microscopio confocal, las células verdes en forma de carrete con fluorescencia intensificada en la punta luminal y una masa de raicillas rojas extendidas indican la presencia de células de mechón.
Para preparar secciones de yeyuno, comience ajustando tanto la temperatura de la cámara de criostato como la temperatura del objeto a menos 22 grados Celsius. Coloque el bloque de tejido congelado en un criomolde en la cámara de criostato durante al menos 15 minutos. Después de 15 minutos, corte el bloque por la mitad con una hoja de afeitar para exponer la sección transversal del yeyuno. Monte la mitad del bloque en un adaptador de criostato. Divida el yeyuno lleno de gelatina en secciones de 30 micras de grosor. Use fórceps congelados para transferir suavemente las secciones a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga 3 mililitros de PBS.
Después de lavar las secciones tres veces durante 5 minutos cada una con 3 mililitros de PBS-T, agregue 3 mililitros de solución de recuperación de antígenos recién preparada al plato que contiene las secciones flotantes. Luego, cierre la tapa, selle el espacio entre el plato y la tapa con una tira de cinta de vinilo e incube a 50 grados centígrados en una incubadora de hibridación durante tres horas sin agitar.
Después de la inmunotinción, transfiera la placa de secciones teñidas en PBS a un microscopio estereoscópico. Coloque 200 microlitros de PBS en una gota en el centro de un portaobjetos de vidrio blanco recubierto de AMS. A continuación, utilice una punta de pipeta P200 para transferir una sección de yeyuno del plato a la gota.
Después de ajustar la alineación de la sección, aspire todo el PBS restante que rodea la sección. Agregue 20 microlitros de medios de montaje acuosos y coloque un cubreobjetos encima del medio. Selle inmediatamente los bordes del cubreobjetos con medios de montaje a base de xileno y déjelos secar durante dos o tres horas antes de comenzar la microscopía confocal.