Una técnica de inmunofluorescencia de doble marcaje para visualizar proteínas del huésped y del patógeno en una célula infectada

Comience con células epiteliales fijas y permeabilizadas infectadas con un parásito patógeno.

Agregue un tampón de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Superposición con anticuerpos primarios policlonales de ratón, que interactúan específicamente con las proteínas del parásito.

Agregue anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo rojo lejano que interactúan con anticuerpos primarios unidos a proteínas parásitas.

Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos. Bloquee con anticuerpos anti-ratón que se unen a anticuerpos primarios, minimizando la reactividad cruzada durante el etiquetado huésped-proteína.

Agregue anticuerpos primarios monoclonales de ratón dirigidos a las ribonucleoproteínas del huésped dentro de las células epiteliales.

Se superpone con una mezcla de anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo verde y faloidina conjugada con fluoróforo rojo, lo que facilita el etiquetado de anticuerpos primarios unidos a proteínas del huésped y actina, respectivamente.

Lavar con un tampón. Montar con un medio que contenga tinción de ADN, impartiendo una coloración azul al núcleo del huésped, al núcleo del parásito y al cinetoplasto.

Analice las muestras con un microscopio confocal. La técnica de inmunofluorescencia de doble marcaje muestra proteínas verdes del huésped y proteínas parásitas rojas, lo que permite su localización subcelular precisa.

Agregue celdas LLC-MK2 en placas de 24 pocillos que contengan cubreobjetos redondeados esterilizados por UV y déjelos reposar durante 16 horas. Luego, para infectar las células, agregue sobrenadante que contenga T. cruzi a cada pocillo e incube durante seis horas. A continuación, lave los cubreobjetos que contienen las células infectadas y no infectadas 5 veces con PBS.

Luego, fije las células con paraformaldehído al 2% y PBS. Después de 10 minutos, lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con PBS y luego permeabilice los cubreobjetos con detergente no iónico durante 10 minutos.

Después de tres lavados de PBS de 5 minutos, incube los cubreobjetos en una solución de bloqueo durante 30 minutos, seguido de otra incubación de 30 minutos con un anticuerpo monoclonal o policlonal de ratón. Después de los lavados, incube los cubreobjetos durante 30 minutos con anticuerpo secundario en solución bloqueadora y faloidina para teñir los filamentos de actina en la célula huésped.

Luego, lave los cubreobjetos con PBS tres veces nuevamente antes de aplicar una pequeña cantidad de reactivo de montaje antidecoloración con medio DAPI en la superficie del portaobjetos. Con unas pinzas, incline suavemente el cubreobjetos en el medio para evitar la formación de burbujas.

Para el doble etiquetado, después de incubar los cubreobjetos y la solución de bloqueo como se demostró anteriormente, incubarlos en el anticuerpo policlonal de ratón durante 30 minutos. A continuación, lave los cubreobjetos tres veces durante 5 minutos cada uno con PBS antes de incubarlos con el anticuerpo secundario durante 30 minutos.

Luego, después de tres lavados de PBS, realice un segundo paso de bloqueo con IgG anti-ratón de conejo AffiniPure diluido en solución de bloqueo. Después de 30 minutos, lave los cubreobjetos con PBS nuevamente antes de incubarlos con el anticuerpo monoclonal de ratón durante otros 30 minutos.

A continuación, después de tres lavados de PBS, incube los cubreobjetos con anticuerpo IgG2b anti-ratón de cabra y faloidina. Luego, después de tres lavados de PBS, aplique el reactivo de montaje antidecoloración como se demostró anteriormente.