Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:18 min. • July 8th, 2025
Tomemos una sección del cerebro murino que consiste en la circunvolución dentada del hipocampo, un sitio para la neurogénesis compuesto por progenitores neuronales en distintas etapas de diferenciación.
Transfiera la sección a una solución que bloquee la permeabilización. Las moléculas de detergente en la solución permeabilizan las células, mientras que las proteínas bloquean los sitios de unión no específicos.
Agregue un cóctel de anticuerpos primarios dirigido a marcadores de neurogénesis específicos, una proteína asociada a microtúbulos y una proteína de filamento intermedio.
Retire los anticuerpos no unidos. Introducir diferentes anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo que se unen a los anticuerpos primarios.
Agregue proteínas séricas del mismo huésped como uno de los anticuerpos primarios, saturando los paratopos en los anticuerpos secundarios.
Introducir fragmentos monovalentes de Fab que saturan los epítopos de las proteínas séricas, evitando la unión inespecífica.
Agregue un segundo anticuerpo primario criado en el mismo huésped, uniéndose a otra proteína de filamento intermedia.
Introducir anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo dirigidos al segundo anticuerpo primario.
Usando microscopía de fluorescencia, identifique los subtipos de progenitores neuronales que expresan combinaciones de marcadores únicas.
Comience transfiriendo las secciones de la solución anticongelante a TBS con la ayuda de un cepillo fino. Enjuague bien las secciones, comenzando con un lavado nocturno a 4 grados centígrados, seguido de cinco lavados de 10 minutos a temperatura ambiente. Todas estas incubaciones deben realizarse con una agitación suave y continua.
Si uno de los antígenos de interés es un análogo de timidina, se debe implementar un paso de desnaturalización del ácido clorhídrico en este punto, seguido de un paso de neutralización en el tampón de borato. Proceda con la permeabilización y el bloqueo de los sitios inespecíficos de unión de anticuerpos en TBS-plus. Deje que esta incubación dure 1 hora a temperatura ambiente.
Luego, incube en el primer anticuerpo primario diluido en TBS-plus durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lave las secciones tres veces en TBS y una vez en TBS-T. Deje que cada baño vaya durante 10 minutos. Luego, incube en el primer anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo durante tres horas a temperatura ambiente. A partir de ahora, proteja las secciones de la exposición a la luz.
Después de otra serie de lavado, transfiera las secciones a una solución de suero de especies huésped al 10% a partir de la cual se fabricaron los dos anticuerpos primarios. Incube las secciones en esta solución durante tres horas para saturar los paratopos abiertos en el primer anticuerpo secundario. Más tarde, enjuague tres veces en TBS y una vez en TBS-T para eliminar el suero.
Luego, prepare una solución de TBS-plus con 50 microgramos por mililitro de fragmentos de Fab monovalentes no conjugados dirigidos contra la especie huésped del anticuerpo primario. Esto cubre los epítopos que de otro modo podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario. Transfiera las secciones a esta solución e incube durante la noche a 4 grados centígrados.
Después de la incubación, enjuague las secciones al menos tres veces en TBS y una vez en TBS-T. Durante las transferencias, limpie los insertos de malla que contienen las secciones en una toalla de papel para eliminar los restos residuales de Fab. Ahora, incube las secciones en el segundo anticuerpo primario durante la noche a 4 grados centígrados.
Después de otra serie de lavado, aplique el segundo anticuerpo secundario durante tres horas a temperatura ambiente. Finalmente, lave las secciones tres veces en TBS y proceda a montar las secciones en gelatina. Seque al aire las guías y cuádalas con un medio de montaje antidecoloración.