Una técnica de inmunomarcaje para visualizar la localización subcelular de proteínas

Comience lavando una sección fija del corazón en un tampón de cacodilato de sodio que estabiliza la estructura del tejido. Sumerja la sección en tetraóxido de osmio para teñir los lípidos de la membrana.

Tratar con acetato de sodio para mantener un pH óptimo para la tinción.

Agregue acetato de uranilo para teñir las biomoléculas, proporcionando un mejor contraste durante la microscopía.

Deshidratar el tejido en concentraciones crecientes de etanol seguido de acetona.

Incruste el tejido en una resina, obtenga secciones ultrafinas y transfiéralas a una rejilla de microscopía.

Introducir metaperiodato de sodio para eliminar el tetraóxido de osmio, desenmascarando la proteína celular.

El compuesto también oxida la glicoproteína, creando grupos aldehídos reactivos, que son neutralizados por el tratamiento con glicina.

Introducir un tampón de bloqueo, evitando la unión de anticuerpos inespecíficos.

Agregue anticuerpos primarios específicos a la proteína diana seguidos de anticuerpos secundarios biotinilados.

Agregue puntos cuánticos conjugados con estreptavidina que se unen a la biotina.

Bajo un microscopio electrónico, las regiones marcadas con puntos cuánticos exhiben un mayor contraste, lo que ayuda a la localización subcelular precisa de la proteína diana.

Después de 24 horas de fijación, lave el tejido en tampón de cacodilato de sodio molar 0,1 dos veces durante 20 minutos. Retire el tejido del tampón de cacodilato de sodio y sumérjalo en una solución de tetróxido de osmio al 2% durante 4 horas a temperatura ambiente.

Después de la osmicación, sumerja el tejido en una solución de acetato de sodio al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, sumerja el tejido en una solución de acetato de uranilo al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la tinción con acetato de uranilo, deshidrate el tejido secuencialmente a través de los alcoholes graduados y la acetona.

Incruste el tejido deshidratado en resina epoxi de baja viscosidad como se describe en el manuscrito. Coloque el tejido en resina fresca en micromoldes de 8 milímetros, moldes y cure el tejido incrustado a 70 grados centígrados durante la noche. Después de encontrar el área de interés con un cuchillo ultra de 45 grados, produzca secciones ultrafinas de oro pálido. Coloque estas secciones ultrafinas en el lado opaco de una rejilla de cobre de malla 200.

Comience la tinción desenmascarando el antígeno colocando 20 microlitros de metaperiodato de sodio de la solución de grabado en una película de parafina limpia. Coloque la rejilla seca con secciones de tejido sobre la gota de la solución de grabado. Deje la rejilla de secciones en la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave las secciones de tejido grabadas colocándolas en una gota de agua destilada durante 60 segundos.

Bloquee los aldehídos residuales colocando la rejilla de sección en una gota de solución de glicina molar 0,05 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro para eliminar la solución de glicina residual. Coloque la rejilla de sección en 10 a 20 microlitros de solución de bloqueo durante 25 minutos a temperatura ambiente.

Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro y coloque las secciones de la rejilla en diluyente de anticuerpos para acondicionarlas a temperatura ambiente durante 10 minutos. Incube las secciones de la rejilla con anticuerpo primario durante 1 hora y 30 minutos en una cámara humidificada. Seque la rejilla y lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante 5 minutos cada una.

Incube las secciones de la rejilla con un anticuerpo secundario biotinilado durante 1 hora en una cámara humidificada. Una vez que la rejilla esté seca, lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante 5 minutos cada una. Incube las secciones de la rejilla en QD conjugado con estreptavidina disponible comercialmente durante 1 hora en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Evite la exposición a la luz cubriendo la cámara con papel de aluminio. Después de secar los bordes de la rejilla con papel de filtro, lave las secciones de la rejilla colocándolas en gotas de agua durante dos minutos y seque los bordes de la rejilla para que se sequen.