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Inmunología
0 vistas • 4:09 min • July 8th, 2025
Tomemos la criosección de una biopsia de piel de un paciente con enfermedad de Parkinson encerrada en un medio de inclusión.
El tejido comprende una epidermis más externa, una dermis subyacente y grasa subcutánea inervada por nervios.
Lave la sección para eliminar el medio de inclusión. Transfiéralo a una solución bloqueadora de permeabilización, permeabilizando las células y bloqueando los sitios de unión no específicos.
Sumerja la sección en un cóctel de anticuerpos primarios para lograr un etiquetado uniforme de anticuerpos, denominado tinción flotante.
Los anticuerpos ingresan a las neuronas y se unen a los agregados de alfa-sinucleína distribuidos a lo largo de los axones, una forma agregada característica de las enfermedades neurodegenerativas, y las carboxilas terminales.
Introducir anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que se unan a los anticuerpos primarios.
Tratar con un tinte de unión al ADN fluorescente que tiñe el núcleo.
Coloque el pañuelo en un portaobjetos, aplique un medio de montaje y selle con un cubreobjetos.
Bajo un microscopio confocal, la fluorescencia de ambos anticuerpos revela la presencia de agregados de alfa-sinucleína a lo largo de los axones de las neuronas dérmicas.
Para comenzar, llene algunos de los pocillos de una placa fresca de 96 pocillos con 100 microlitros de solución de lavado. Transfiera las secciones a analizar de la placa de almacenamiento a la que contiene la solución de lavado. Deje las secciones en la solución de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera cada sección a un pocillo vacío que contenga la misma solución de lavado y repita el lavado. Luego, agregue una solución de lavado a las secciones y transfiéralas a nuevos pocillos que contengan 100 microlitros de solución de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 90 minutos y un máximo de 4 horas.
Diluir los anticuerpos primarios, anti-PGP9.5 y anti-5G4 en la solución de trabajo. Transfiera las secciones a nuevos pocillos que contengan 100 microlitros de la solución de trabajo de los anticuerpos primarios e incube durante la noche a temperatura ambiente.
Al día siguiente, lave las secciones en pocillos que contengan solución de lavado como se describió anteriormente. Diluya los anticuerpos secundarios: anti-conejo de cabra para detectar anti-PGP9.5 y anti-ratón de cabra para detectar 5G4 en la solución de trabajo.
Transfiera las secciones lavadas a nuevos pocillos que contengan 100 microlitros de la solución de trabajo de los anticuerpos secundarios. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar el blanqueo de fluoróforos conjugados con anticuerpos secundarios e incube a temperatura ambiente durante 90 minutos.
Después de esto, lave las secciones dos veces en una solución de lavado como se describió anteriormente. Transfiera las secciones lavadas a pocillos nuevos que contengan 100 microlitros de DAPI durante 5 minutos a temperatura ambiente. Lave las secciones dos veces en la solución de lavado como se describió anteriormente. Luego, monte las secciones en una corredera en la posición correcta, evitando que se plieguen mal.
Agregue unas gotas de medio de montaje a la corredera y cubra la sección con un cubreobjetos. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche. Al día siguiente, guarde los portaobjetos en una caja adecuada a 4 grados centígrados, asegurándose de evitar la exposición a la luz.
Usando un microscopio de fluorescencia invertida o un microscopio confocal, vea las secciones. Adquiera las imágenes mediante una cámara conectada al microscopio. Luego, use un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal para analizar señales positivas en secciones, en términos de distribución espacial e intensidad de la señal, como se describe en el protocolo de texto.