Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:15 min. • July 8th, 2025
Tome una matriz de péptidos derivada del antígeno leucocitario humano de un donante de órganos o de la secuencia HLA que comprende diferentes péptidos en la membrana de celulosa.
Cada péptido lleva al menos un desajuste de aminoácidos entre la secuencia HLA del donante y el receptor, lo que representa un epítopo potencial para el rechazo de órganos mediado por anticuerpos.
Tratar con un tampón de bloqueo para evitar la interacción inespecífica de anticuerpos.
Agregue suero receptor recolectado después del trasplante de órganos, que contiene aloanticuerpos.
Estos anticuerpos, formados contra el HLA del donante, se unen a su epítopo diana.
Agregue un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa que se una al aloanticuerpo.
Agregue sustrato quimioluminiscente y peróxido de hidrógeno. La peroxidasa utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar el sustrato, emitiendo luz.
Escanee la membrana para obtener una imagen.
Agregue un tampón para eliminar los anticuerpos unidos. Vuelva a sondear con suero receptor pretrasplante y obtenga una imagen.
En comparación con la imagen previa al trasplante, las manchas oscuras en la imagen posterior al trasplante indican epítopos HLA específicos del donante que incitan a la reactividad de aloanticuerpos.
Cuando se hayan sintetizado las matrices, bloquee las membranas con 20 mililitros de leche descremada al 5% disuelta en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 al 0,1% o TBST durante el período de incubación apropiado con balanceo. A continuación, lave la membrana tres veces con 20 mililitros de TBST fresco durante 5 minutos por lavado, seguido de la incubación con 20 microlitros de suero crudo receptor en leche al 2,5% en TBST durante 2 a 3 horas a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave la membrana tres veces durante 10 minutos por lavado e incube las membranas con anticuerpo secundario IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante humano de cabra durante dos horas.
Retire el anticuerpo secundario no unido con tres lavados de 10 minutos en TBST y desarrolle las membranas en 5 mililitros de solución de luminol recién preparada más 5 mililitros de solución de peróxido. Después de un minuto, visualice las señales de quimioluminiscencia mejoradas en un generador de imágenes adecuado.
Después de guardar las imágenes reveladas, incube las membranas con 20 mililitros de tampón de extracción comercial a 37 grados Celsius durante 20 minutos, seguido de tres lavados de 10 minutos en TBST. Luego, bloquee, vuelva a sondear y visualice las membranas como se acaba de demostrar con una muestra de suero del mismo paciente obtenida en un momento diferente.