Detección de anticuerpos antiglicanos circulantes con una matriz de glicanos impresa

Comience con un glicochip funcionalizado con submatrices de glicanos impresas organizadas en bloques de matrices.

Cada punto en la submatriz representa un glicano distinto, un polímero a base de carbohidratos con variaciones en la composición de monosacáridos, la longitud de la cadena y el patrón de ramificación.

Trate el glicochip con un tampón de bloqueo para bloquear sitios de interacción no específicos.

Transfiera el glicochip e introduzca suero de ratón diluido en un tampón suplementado con surfactante para minimizar la agregación de anticuerpos. Incubar bajo agitación.

La agitación promueve una distribución uniforme del suero, facilitando la unión selectiva de anticuerpos antiglicanos a glicanos específicos en función de características moleculares distintas.

Lavar con concentraciones decrecientes de un tampón que contenga tensioactivo para alterar la unión no específica y enjuagar.

Superponga el glicochip con anticuerpos secundarios conjugados con biotina anti-ratón, interactuando con anticuerpos anti-glicanos preunidos y lavado.

Introducir estreptavidina marcada con fluoróforo, que se une a anticuerpos secundarios biotinilados. Lave y retire el exceso de solución.

Escanee el glicochip y observe si hay distintos puntos de fluorescencia en varias posiciones que sugieran anticuerpos circulantes específicos de glicanos en suero.

Prepare el búfer #1 a través del búfer #4 como se describe en el protocolo de texto. Para preparar los glicochips y las muestras, coloque la caja de almacenamiento con los portaobjetos sobre la mesa hasta que alcancen la temperatura ambiente. Abra la caja y transfiera el glicochip a la cámara de incubación, que ya debe estar acondicionada con papel de filtro húmedo para mantener la humedad constante dentro de la cámara.

Mientras tanto, diluya el suero de los ratones con tampón 1 en tubos de 1,5 mililitros. Homogeneizar la solución de suero durante 5 segundos con un mezclador de vórtice. Después de la homogeneización, incubar el suero diluido a 37 grados centígrados durante 10 minutos en un baño de agua para evitar la agregación de inmunoglobulinas. Luego centrifugar los tubos durante 3 minutos a 10.000 veces g y 25 grados centígrados.

Recoja el sobrenadante y deseche cualquier material precipitado. Coloque el glicochip con cuidado en la cámara de incubación. Incubarlo con 1 mililitro de tampón #3 para eliminar cualquier material residual en la superficie del glicochip. Durante 15 minutos, a 25 grados centígrados, sostenga el glicochip en posición vertical y vuelva a lavarlo con unas gotas de tampón #3 con una pipeta Pasteur de plástico.

Luego, retire con cuidado el tampón de la superficie del glicochip con papel de filtro. Vuelva a colocar el glicochip en la cámara de incubación. Extienda la muestra de suero diluido sobre la superficie del glicochip con una micropipeta. Asegúrese de que todas las áreas secas de la superficie del glicochip estén cubiertas por la muestra de suero diluido con la punta de la pipeta.

Incubar con agitación orbital a 37 grados centígrados durante 1 hora y media. Después de la incubación, retire cualquier exceso de muestra y sumerja el glicochip durante 5 minutos en el tampón # 3 a 25 grados Celsius. Pasa el glicochip a un recipiente con tampón #4, y por último, lava el glicochip con agua ultrapura.

Centrifugar el glicochip durante 1 minuto a 175 veces g y 25 grados centígrados para eliminar el líquido. Después de volver a colocar el glicochip en la cámara de incubación, extienda una solución de anti-ratón de cabra conjugado con biotina sobre la superficie del glicochip. Incubar con agitación orbital a 37 grados centígrados durante una hora. Retire la fracción libre y repita los pasos de lavado.

Después de la centrifugación, incube el glicochip en la oscuridad a 25 grados Celsius durante 45 minutos con 2 microgramos por mililitro de la solución de estreptavidina marcada con fluorocromo correspondiente en el tampón # 2. Después de trabajar en la oscuridad para eliminar la fracción libre y repetir los pasos de lavado, seque el glicochip al aire.

Para escanear la matriz, deje el glicochip sobre la mesa hasta que alcance la temperatura ambiente en la oscuridad. Al mismo tiempo, encienda el escáner de portaobjetos y el láser. Sosteniendo el microarray, deslice el glicochip en la ranura hasta que toque la parte posterior. Escanee el glicochip ejecutando Easy Scan y guarde el escaneo como un archivo .tiff.