Inmunolocalización de proteínas arabinogalactanos y pectinas en tejido vegetal

Tome un portaobjetos con pocillos de reacción que contengan secciones delgadas de diferentes tejidos vegetales. Los tejidos se fijan e incrustan dentro de una resina para la inmunotinción.

Coloque el portaobjetos dentro de una cámara de incubación oscura y húmeda para evitar la exposición a la luz y la evaporación del reactivo durante los pasos posteriores.

Introducir una solución de bloqueo para evitar la interacción inespecífica de anticuerpos.

Lave para eliminar el exceso de solución de bloqueo, luego agregue anticuerpos primarios específicos de antígeno e incube.

Los anticuerpos se unen a sus antígenos diana, es decir, proteínas arabinogalactanos y pectinas en la pared celular.

Introducir anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos, que se unen a los anticuerpos primarios.

Lave para eliminar los anticuerpos no unidos y aplique un tinte fluorescente que se une a la celulosa, marcando la pared celular.

Agregue un medio de montaje y selle con un cubreobjetos.

Bajo un microscopio, la fluorescencia del colorante y los anticuerpos unidos ayudan a visualizar la celulosa en las paredes celulares de las plantas colocalizadas con proteínas arabinogalactanas o pectina, exhibiendo su distribución específica de tejido.

Para preparar una cámara de incubación para los portaobjetos de reacción, coloque algunas toallas de papel humedecidas en el fondo de una caja de puntas de pipeta y envuelva la caja con papel de aluminio. Transfiera los portaobjetos de la caja a la cámara de incubación. Pipetear 50 microlitros de solución de bloqueo en cada pocillo. Después de incubar el portaobjetos durante 10 minutos, retire la solución de bloqueo. Luego, lave todos los pocillos dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez. Después de preparar las soluciones de anticuerpos primarios como se describe en el manuscrito, realice un lavado final de los pocillos con agua destilada y desionizada durante 5 minutos.

Pipetear la solución de anticuerpos primarios en los pocillos de reacción. Luego, pipetee la solución de bloqueo en los pocillos de control. Cierre la cámara de incubación. Déjelo reposar durante dos horas a temperatura ambiente y luego refrigérelo durante la noche a 4 grados centígrados. Prepare una solución al 1% del anticuerpo secundario en la solución de bloqueo. Se necesitarán aproximadamente 40 microlitros por pozo.

Cubra la solución con papel de aluminio. Lave los pocillos del portaobjetos de reacción dos veces con PBS y una vez con agua destilada y desionizada durante 10 minutos cada vez. Asegúrese de que no quede solución de bloqueo ni depósitos en los pozos. Pipetee la solución de anticuerpos secundarios en todos los pocillos. Incube los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 3 a 4 horas.

Nuevamente, lave los pocillos del portaobjetos de reacción dos veces con PBS y una vez con agua destilada y desionizada. Luego agregue una gota de calcofluor-white a cada pocillo. Sin lavar, agregue una gota de medio de montaje a cada pocillo y cubra cada pocillo con un cubreobjetos. Observe las secciones de muestra en el portaobjetos de reacción con un microscopio de fluorescencia.

Para cada observación, use un filtro UV para detectar las paredes celulares teñidas por el calcofluor y un filtro FITC para detectar la inmunolocalización. Para una mejor visualización de los resultados, use ImageJ o un programa de análisis de imágenes similar para fusionar cada imagen de filtro UV con la imagen de filtro FITC correspondiente.