Uso de un ELISA sándwich para determinar el contenido de glicoproteínas inmunogénicas en una vacuna

Comience con una placa de ensayo pasivada recubierta con anticuerpos monoclonales inmunogénicos específicos de glicoproteína antirrábica y un agente bloqueador para evitar interacciones no específicas.

Introducir vacunas antirrábicas de referencia diluidas en serie y probar con contenido decreciente de glicoproteínas. Selle la placa para evitar la contaminación.

Durante la incubación, las glicoproteínas inmunogénicas interactúan con anticuerpos monoclonales recubiertos a través de un sitio antigénico específico.

Después de la incubación, retire la película, aspire el sobrenadante y lave la placa.

Superposición con anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas conjugados con enzimas que se unen a un sitio antigénico diferente en la glicoproteína, formando un inmunocomplejo.

Agregue una solución que contenga un sustrato y un cromógeno. Cuando el sustrato interactúa con la enzima, provoca la oxidación del cromógeno, cambiando el color de la solución.

Agregue una solución de parada para inactivar las enzimas.

Mida la absorbancia y genere una curva de referencia utilizando los valores de referencia de la vacuna.

Identificar la región donde existe una relación lineal entre la absorbancia y el contenido de glicoproteína de las diluciones de referencia de la vacuna. Luego, extrapola el contenido de glicoproteína de las diluciones de la vacuna de prueba en función de la absorbancia que se encuentra dentro de esta región.

Para lavar la cuchilla, agregue 300 microlitros del tampón de lavado a cada pocillo. Luego, aspire con cuidado y transfiera el contenido del pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,6%. Repita este proceso de lavado cinco veces más para lavar extensamente la placa sensibilizada.

Después de esto, invierta la microplaca y déjela secar sobre un trozo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto. Reconstituir la vacuna de referencia en un mililitro de agua destilada de modo que la concentración final de glicoproteína del virus de la rabia sea de 10 microgramos por mililitro. Preparar una dilución de 10 veces de la vacuna de referencia reconstituida en el diluyente para alcanzar una concentración de glicoproteína del virus de la rabia de un microgramo por mililitro.

A continuación, realice seis diluciones dobles en serie de esta vacuna de referencia en el diluyente como se describe en la tabla uno del protocolo de texto. Distribuya 200 microlitros del diluyente en pocillos duplicados para que sirvan como control en blanco, y 200 microlitros por pocillo para cada dilución de vacuna de referencia por duplicado.

Luego, prepare una dilución de 10 veces de la vacuna probada en el diluyente y prepare siete diluciones en serie dobles de la vacuna probada en diluyente como se describe en la tabla dos del protocolo de texto. Distribuya 200 microlitros de cada dilución de vacuna probada por duplicado a cada pocillo de la microplaca. Cubra la microplaca con una película adhesiva e incube a 37 grados centígrados durante una hora.

Después de esto, retire la película, aspire con cuidado y transfiera el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,7%. Para lavar la placa, agregue 300 microlitros de tampón de lavado a cada pocillo. Aspire con cuidado y transfiera el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,6%.

Repita el proceso de lavado cinco veces más para eliminar el antígeno no unido y conservar los trímeros de proteína G unidos al anticuerpo recubierto. Invierta la microplaca lavada y déjela secar sobre un trozo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto. Luego, distribuya 200 microlitros de la dilución recomendada de anticuerpo monoclonal D1 marcado con peroxidasa en diluyente a cada pocillo.

Cubra la microplaca con una película adhesiva e incube a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la película, aspire con cuidado y transfiera el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,6%. Para lavar la microplaca, agregue 300 microlitros de tampón de lavado a cada pocillo.

Aspire con cuidado y transfiera el contenido de cada pocillo a un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 2,6%. Repita este proceso de lavado cinco veces más para eliminar el anticuerpo marcado con peroxidasa no unido. Invierta la microplaca de lavado y déjela secar sobre un trozo de papel absorbente a temperatura ambiente durante un minuto.

A continuación, distribuya 200 microlitros de solución de cromógeno de sustrato en cada pocillo. Selle la microplaca con una película e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Luego, agregue 50 microlitros de solución de parada en cada pocillo para detener la reacción.

Con cuidado, limpie la parte inferior de la microcuchilla y colóquela en un espectrofotómetro. Determine la densidad óptica a 492 nanómetros para todos los pocillos utilizados. Recopile estos datos en un archivo de hoja de cálculo para su análisis. Después de esto, cree gráficos tanto para la curva de la vacuna de referencia como para los valores de densidad óptica como se describe en el protocolo de texto.