Name: El colágeno organotípicos I del ensayo: Una plataforma maleable para evaluar el comportamiento celular en un contexto de 3 dimensiones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a preparar matrices de colágeno tridimensionales con fibroblastos humanos primarios para estudiar la migración celular y la invasión tumoral. Este método permite analizar interacciones célula-estroma mediante microscopía de fluorescencia.

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1. Establecimiento de cultivos de fibroblastos de explantes de piel <ol><li> 4 mm biopsias adquiridas de antebrazo humano se colocan en MEM suplementado 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml y 0,25 mg / ml Fungizone. </li><li> Recortar la grasa subcutánea y picar finamente la biopsia en trozos pequeños, colocándola un número de 24 hoja de bisturí en contra de la parte inferior de la placa de Petri. </li><li> Mezcla de tejidos en lugar de 25 cm 2 frasco de cultivo de tejidos con los medios de comunicación primario de crecimiento de fibroblastos (MEM suplementado con 10% FCS, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100 mg / ml y 25 mg / Fungizone ml) hasta que la superficie del recipiente es cubierta, pero la profundidad del líquido es insuficiente para el tejido a flotar. </li><li> Después de tres días de incubación a 37 ° C en una atmósfera húmeda de CO2 al 5%, añadir 3 ml de medio de crecimiento de fibroblastos primarios. </li><li> Después de otros 3 días los medios de comunicación el cambio de la incubación con los medios de comunicación primaria fresca de crecimiento de fibroblastos, o si las células son casi confluentes que se puede dividir en 1:04 medio fresco. (Fungizone se puede omitir a partir de este punto). </li></ol> 2. Etapa I - Preparación de colágeno I de la cola de rata Nota: El Protocolo de aproximadamente 12 a 14 colas de rata adolescente (frescas o congeladas) <ol><li> Preparar la cola de rata por el lavado en etanol al 70% y eliminar los tendones de la siguiente manera: </li><li> Quite la piel de la cola de rata por corte en el centro de la cola de arriba a abajo con una. Bisturí y repique a lo largo de la longitud de la cola </li><li> Separar el tendón del núcleo de la región proximal de la cola. </li><li> Quitar el tendón hacia la región distal de la cola para evitar la vaina con pinzas dentadas. </li><li> Extracto de 1 g de tendón / 250 ml de 0,5 M de ácido acético por agitación a 4 º C durante 48 h. </li><li> Centrifugar (7.500 xg) durante 30 minutos y desechar el sedimento. </li><li> Añadir un volumen igual de 10% (w / v) NaCl al sobrenadante, y se agita durante 30-60 min. </li><li> Centrífuga (10.000 xg) durante 30 minutos, descartar el sobrenadante y volver a disolver el precipitado en 0,25 M de ácido acético en una proporción de 1:1 ~ por agitación durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Dializar la solución de colágeno en contra de 6-8 cambios de 6L ~ 17,5 mM de ácido acético (1 ml de ácido acético glacial por litro de agua fría, el cambio de 2 veces al día). </li><li> Centrífuga dializados colágeno a 30.000 xg durante 1,5 horas. </li><li> Aspirar el sobrenadante y el lugar en el frasco estéril. </li><li> Ajustar el colágeno I concentración de ~ 2 mg / ml con 0,5 mM de ácido acético a 4 ° C. </li></ol> 3. Etapa II - Creación de la matriz 3D con fibroblastos embebidos (permite contratar durante 8 días). <ol><li> Montar la mezcla con los reactivos en frío a 4 ° C en una botella de pre-enfriado. Mantenga a que el colágeno en el hielo. </li><li> Para un frasco de T75 confluente fibroblastos primarios (~ el número de células 1 x 10 6) se utiliza: <ul><li> 25 ml de cola de rata colágeno (aprox. conc 2mg/ml) </li><li> 3 ml 10xMEM </li><li> 0,22 M NaOH: en primer lugar, añadir 2 ml, y luego, gota a gota mientras se agita, hasta que el colágeno se torna naranja, </li><li> pero no de color rosa (generalmente hasta 3 ml). P aproximado H = 7,2. </li><li> Nota: Es importante asegurarse de que el medio / gel permanece neutro o ligeramente ácido, como los fibroblastos no se contrae el gel si se expone a ligeramente alcalino. </li></ul></li><li> Trypsinise los fibroblastos, giran a 400 xg durante 5 minutos y retirar el sobrenadante. </li><li> Durante 5 minutos por encima de giro: Prepare 12 x 35 mm platos de plástico - normalmente alcanzar 12 platos de un frasco de fibroblastos / mezcla de colágeno. </li><li> Vuelva a suspender los fibroblastos en 3 ml de FCS, e inmediatamente después a la mezcla de colágeno y revuelva. </li><li> Placa de aproximadamente 2,5 ml de colágeno / fibroblasto por plato tan pronto como sea posible. Trate de evitar las burbujas y la creación de colágeno. </li><li> Deje que el colágeno a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 en el aire durante 10 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de medio de crecimiento de fibroblastos (DMEM + 10% FCS). </li><li> Separe la matriz de colágeno / fibroblasto de los lados de la cápsula, utilizando una pipeta. </li><li> Al día siguiente: Añadir 1 ml de medio de crecimiento de fibroblastos (DMEM + 10% FCS). </li><li> Cambiar los medios de comunicación todos los días. Permitir colágeno / fibroblasto de la matriz se contraiga durante aproximadamente 8 días, hasta que encajen en una placa de 24 pocillos (contracción de ~ 3,5 cm a 1,5 cm de diámetro, ver Figura 1). </li></ol> Nota: La concentración de colágeno se debe ajustar para adaptarse a la aplicación. Cuanto más se diluye la solución de colágeno, más rápido será contratado por los fibroblastos. Pequeñas diferencias en el ritmo de contracción se experimentará con diferentes lotes de colágeno en la misma concentración. Del mismo modo, las diferentes culturas de fibroblastos se contraerá los geles de colágeno a un ritmo diferente, y presentar los fibroblastos, más rápido el ritmo de contracción. Concentración de colágeno y la densidad de los fibroblastos, por consiguiente, ajustado a modificar el ritmo de contracción,y la densidad final del gel de colágeno. 4. Etapa II - Revestimiento de las células de interés en la parte superior de la matriz Nota: Esterilice todas las pinzas y el equipo con etanol antes de su uso. <ol><li> El uso de pinzas romas, mueva suavemente la matriz contratado para 24 y plato. Asegúrese de que no se pliega. </li><li> Prepare una suspensión de células de interés de aproximadamente 4 x 10 1 ml 4 / ml y una placa (después de trypsinising, girar las células para deshacerse de la tripsina) en la parte superior de la matriz. El número real de células necesarias pueden variar dependiendo del tipo de célula utilizada. Medio celular debe ser un medio de crecimiento normal de las células de interés. </li><li> Permiten a las células a crecer hasta la confluencia en la parte superior de la matriz, de aproximadamente 3-5 días. </li></ol> 5. Etapa III - La transferencia de la matriz a una red para la invasión (aproximadamente 0-21 días) <ol><li> Cortar las rejillas de acero inoxidable para crear un trípode y un autoclave antes de su uso (ver Figura 2). </li><li> Colocar malla estéril en una fuente de 6 cm, añadir medio de crecimiento a un nivel por encima de la rejilla (aprox. 10.5ml). Lugar de la matriz en la parrilla y con cuidado aspirar los medios de comunicación por lo que la parte inferior de la matriz está en contacto con los medios de comunicación, pero no sumergida. Esto se conoce como la interfase aire / líquido, lo que crea un gradiente que promueve la invasión. Vuelva a colocar medio cada dos días (ver Figura 2). </li><li> De células vivas, imágenes contextuales usando células fluorescentes se pueden visualizar en esta etapa o antes. El colágeno fibrilar contratados o que se pueden visualizar utilizando la generación de segundo armónico (SHG, ver figura 3). El uso de múltiples fotones de excitación combinada con un amplio campo de detección, encontramos que los grupos de autoayuda pueden ser reflejados por lo menos 100 m en la matriz, mientras que las células que expresan GFP citoplasma se pueden visualizar por lo menos 200 m de profundidad. </li></ol> Nota: Con respecto a la cuantificación de la invasión, el día en que matricies se colocan en las redes define el día 0. Colocación en redes genera un gradiente de medios de cultivo celular que promueve la invasión de la matriz. Las muestras se pueden visualizar en los próximos 1 a 21 días (o más) para evaluar los procesos biológicos, como la invasión, la proliferación, la supervivencia o diferenciación (Ver la lista de referencia). 6. Etapa IV - Fijación <ol><li> Añadir 5 ml de PFA al 4% en un tubo Falcon. </li><li> Transferencia de la matriz sobre una superficie plana. Corte la matriz por la mitad con un nuevo bisturí limpio (como se le mancha la sección transversal), levante la matriz con el bisturí y la transferencia de PFA al 4%, solución durante la noche. </li><li> Matrices organotípicos Ahora está listo para teñir con anticuerpos / mancha de la elección (ver Figura 3). </li></ol> 7. Los resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Ejemplo de fibroblastos-colágeno contraído I. Mezcla de fibroblastos y el colágeno cola de rata separado de la placa de Petri y se deja más de contrato 6-8 días. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 progresión ensayo organotípicos. Un esquema de conjunto organotípicos y progresión. B, Ejemplo de matriz de colágeno / fibroblasto en la parte superior de acero inoxidable, malla estéril para crear interfase aire / líquido. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Las solicitudes de ensayo organotípicos. A, B adenocarcinoma de páncreas no es invasivo y ductal invasivo (PDAC), las células invasoras a través del tiempo con la matriz organotípicos. C, equivalente a piel viva que muestra una epidermis estratificada en un fibroblasto contratados componente dérmico de colágeno. D, C8161 células del melanoma invasor en un fibroblasto contratada equivalente de colágeno dérmico. E, que invada las células PDAC (verde), que interactúan con los fibroblastos y la invasión (en rojo) dentro de la matriz organotípicos. F, que invada las células PDAC (verde), que interactúan con una degradación de la matriz extracelular circundante (púrpura) visualizan mediante multifotónica basado en la generación del segundo armónico.

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Aquí presentamos un método para la producción de una matriz de tres dimensiones adecuadas para el estudio de la migración de células invasivas 6-8. La matriz está formada por colágeno tipo 1 fibrillas, que son contratados por un período de varios días por fibroblastos primarios epidérmico humano. El colágeno es extraído el ácido, la digestión no enzimática, que conserva la reactividad en los extremos de poli-péptido y promueve el entrecruzamiento de las fibrillas de colágeno en grandes agregados en la neutralización de 9 de las condiciones de amortiguación. Esto se traduce en un gel reconstituido que más se asemeja mucho a las características de colágeno en vivo y tiene importantes consecuencias para la capacidad invasora de las células cultivadas en los geles. No importa si el material de partida fresca o congelada se utiliza, pero el uso de colas de ratas adolescentes es importante porque la reticulación del colágeno es más lábil en animales más jóvenes. Colágeno I de los animales más jóvenes por lo tanto, es más fácil de extraer y re-constituye con mayor fidelidad. La matriz de colágeno pueden ser fijadas y teñidas con anticuerpos dirigidos contra cualquiera de las células tumorales invasoras o los fibroblastos del estroma 2,10 y son muy útiles para probar la eficacia de los fármacos que pueden inhibir la invasión 5,6. Aunque este protocolo sugiere el uso de primaria fibroblastos de piel humana, es factible el uso de fibroblastos primarios de otros tipos de tejidos, de acuerdo con el tipo de tejido bajo investigación. También es posible establecer cultivos con fibroblastos inmortalizados, incluyendo las células que han sido transfectadas establemente con los conjugados proteína fluorescente. De esta manera, las células del estroma y los tumores pueden ser etiquetados para visualizar interacciones célula-célula durante la invasión 11.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> MEM 10 veces </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> 367176-500G </td><td> Prepare 0,22 M de valores en el agua </td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-101 </td><td> - </td></tr><tr><td> Placas de 35 mm </td><td> Halcón </td><td> 353001 </td><td> Para el paso 3.4 </td></tr><tr><td> Placas de 60 mm </td><td> Halcón </td><td> 353004 </td><td> Para el paso 5.2 </td></tr><tr><td> Primavera pinza roma </td><td> Samco </td><td> E003/02 </td><td> Dientes, no sin problemas </td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td> Electron Microscopy Servicios </td><td> 15710 </td><td> Diluir al 4% en PBS antes de su uso </td></tr><tr><td> Pantallas de cd-1, el tamaño de malla de 40 </td><td> Sigma </td><td> S07707-5EA </td><td> Rejillas de acero inoxidable, 5 por paquete </td></tr><tr><td> Tubos de diálisis </td><td> Medicell Internacional </td><td> 7607 2295 </td><td> 12 a 14 kD </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Oxoid </td><td> BR0014G </td><td> - </td></tr><tr><td> Ácido Acético </td><td> Sigma </td><td> 242853 </td><td> - </td></tr><tr><td> 24 platos y </td><td> Halcón </td><td> 353047 </td><td> Para el paso 4.1 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> En Vitrogen </td><td> 15290018 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

el colágeno organotípicos i del ensayo: una plataforma maleable para evaluar el comportamiento celular en un contexto de 3 dimensiones

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Migración de las células es fundamental para muchos aspectos de la biología, incluyendo el desarrollo de la cicatrización de heridas, las respuestas celulares del sistema inmunológico, y la metástasis de las células tumorales. La migración se ha estudiado en cubreobjetos de vidrio a fin de que las dinámicas celulares susceptibles de investigación por microscopía de luz. Sin embargo, ha quedado claro que muchos aspectos de la migración de las células dependen de las características del entorno local, incluyendo su elasticidad, la composición de proteínas, y el tamaño de los poros, que no están fielmente representados por dos sustratos rígidos dimensiones como el vidrio y de plástico de 1. Además, la interacción con otros tipos celulares, incluyendo fibroblastos del estroma 2 y 3 células del sistema inmune, se ha demostrado que desempeñan un papel fundamental en la promoción de la invasión de las células cancerosas. Investigación a nivel molecular ha demostrado que cada vez más dinámica molecular, incluyendo la respuesta al tratamiento farmacológico, de células idénticas son significativamente diferentes en comparación in vitro e in vivo 4. Idealmente, sería mejor para estudiar la migración de células en su contexto natural en los organismos vivos, sin embargo, esto no siempre es posible. Intermedio sistemas de cultivo de tejidos, tales como la matriz de células derivadas, matrigel, la cultura organotípicos (descrito aquí) explantes de tejidos, organoides, y xenoinjertos, son importantes intermedios experimental. Estos sistemas aproximada ciertos aspectos de un entorno en vivo, pero son más susceptibles a la manipulación experimental, como el uso de líneas celulares transfectadas de forma estable, los regímenes de tratamiento de drogas, a largo plazo y de imágenes de alta resolución. Tales sistemas intermedios son especialmente útiles como demostrando los motivos para validar las sondas y establecer los parámetros necesarios para la imagen de la respuesta dinámica de las células y los reporteros fluorescentes antes de realizar imágenes en vivo 5. Como tales, pueden desempeñar un papel importante en la reducción de la necesidad de que los experimentos en animales vivos.

Se describe un método para la preparación de una matriz de tres dimensiones que consiste en colágeno tipo I y fibroblastos primarios humanos. Este gel organotípicos sirve como un sustrato útil para evaluar la migración de células invasivas debido a que imita las características básicas del estroma y se presta a muchas formas de microscopía.

El colágeno organotípicos I del ensayo: Una plataforma maleable para evaluar el comportamiento celular en un contexto de 3 dimensiones

La migración celular es fundamental para muchos aspectos de la biología, incluidos el desarrollo, la cicatrización de heridas, las respuestas celulares del sistema inmunitario y ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer una matriz tridimensional de colágeno similar a un tejido para estudiar la función celular. Esto se logra primero extrayendo colágeno de los tendones de la cola de rata. A continuación, las fibras de colágeno se reconstituyen en presencia de fibroblastos para permitir que los fibroblastos contraigan el gel de colágeno.En el tercer paso, las células tumorales se colocan encima de la matriz en la etapa final. La matriz se incuba sobre una rejilla metálica para crear una interfase aire-líquido que permita la invasión de las células tumorales dentro de la matriz. Finalmente, se puede realizar tinción inmunohistoquímica y microscopía de fluorescencia para analizar la síntesis de la matriz, la migración celular, incluyendo la invasión de células tumorales y las interacciones entre diferentes tipos celulares.Por lo tanto, este método es ideal para estudiar la invasión y la metástasis, así como el desarrollo tumoral. En una matriz tridimensional compleja, podemos analizar aspectos como la diferenciación, la supervivencia celular y el crecimiento celular. Pero en particular, podemos examinar cómo las células tumorales interactúan con el estroma durante eventos clave de la invasión.Una de las primeras etapas del propio proceso de metástasis del cáncer es establecer cultivos de fibroblastos a partir de implantes de piel. Coloque primero unas gotas de MEM suplementado con penicilina, estreptomicina y fungizona en el fondo de una placa de Petri. Luego, coloque biopsias de cuatro milímetros de diámetro obtenidas de un antebrazo humano dentro de la placa.A continuación, finalmente, corte la biopsia en trozos pequeños moviendo una hoja de bisturí número 24 contra el fondo de la placa de Petri. Coloque la pasta de tejido en un frasco de cultivo de tejidos de 25 centímetros cuadrados. Luego vierta el medio de crecimiento de fibroblastos primarios sobre el tejido.Esto es suficiente para cubrir la superficie del matraz, pero es insuficiente para que el tejido flote. Incube el matraz durante tres días a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida de 5%CO2, y luego agregue tres mililitros de medio de crecimiento primario para fibroblastos tras otros tres días de incubación. Cambie el medio por medio de crecimiento primario fresco para fibroblastos.Si las células están casi confluentes, se pueden dividir uno a cuatro en nuevos frascos con medio fresco. Comience lavando las colas de rata en etanol al 70 % y enfríe una botella de ácido acético 0,5 molar a cuatro grados Celsius para extraer los tendones de las colas de rata. Primero, retire la piel de cada cola de rata individual.A continuación, separe el tendón del núcleo de la región proximal de la cola. Finalmente, retire el tendón hacia la región distal de la cola utilizando pinzas dentadas. Una vez que se hayan eliminado los tendones, agregue 250 mililitros de ácido acético 0,5 molar a un matraz cónico de vidrio.Extraiga un gramo de tendón por cada 250 mililitros de ácido agitando a cuatro grados Celsius durante 48 horas después de la extracción del tendón. Centrifugue la solución de ácido y tendón a 7.500 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y luego deseche el precipitado. A continuación, añada un volumen igual de NaCl al 10% peso por volumen al sobrenadante y agite durante un tiempo adicional de 30 a 60 minutos tras el segundo paso de agitación.Centrifugar la solución. Esta vez a 10.000 × g, desechar el sobrenadante y redisolver el precipitado en ácido acético 0,25 M con agitación adicional durante 24 horas a cuatro grados Celsius. A continuación, dializar la solución de colágeno frente a seis a ocho cambios de seis litros de ácido acético aproximadamente 17,5 mM.Después de la diálisis, centrifugar el pellet de colágeno a 30.000 ×g durante 1,5 horas. Finalmente, transferir el sobrenadante a un frasco estéril y ajustar la concentración de colágeno a aproximadamente dos miligramos por mililitro con ácido acético 0,5 milimolar previamente enfriado, y luego mantener el colágeno sobre hielo. Primero, seleccionar tres frascos T75 con fibroblastos primarios confluentes.Coloque un recipiente de SFC a cuatro grados Celsius para enfriarlo. A continuación, agregue 75 mililitros del colágeno de cola de rata previamente preparado en una botella de vidrio estéril de 100 mililitros previamente enfriada. Luego agregue nueve mililitros de 10 XMEM mientras agita la mezcla.Agregue seis mililitros de hidróxido de sodio 0,22 normal, disminuyendo la velocidad al acercarse al último mililitro. Para asegurar que el color final se encuentre entre naranja y rosa. Incube los ojos con tripsina, los fibroblastos y luego centrifugue las células a 400 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Durante la centrifugación, prepare 36 placas de plástico de 35 mm. Suspender el precipitado en 10 mililitros de FCS previamente enfriado y añadir inmediatamente los fibroblastos al colágeno. Mezclar y agitar, e inocular aproximadamente 2,5 mililitros de la mezcla de colágeno-fibroblastos por placa de 35 mm lo más rápidamente posible.Evite la formación de burbujas y la solidificación del colágeno. Coloque las placas en el incubador durante 10 minutos para permitir que el colágeno forme un gel débil, y luego añada un mililitro de medio de crecimiento de fibroblastos a cada placa. A continuación, desprenda la matriz de colágeno-fibroblastos de los bordes de la placa utilizando una pipeta y regrese las placas al incubador.Al día siguiente, agregue otro mililitro de medio de crecimiento Fiberblast a las placas. Luego, cambie el medio cada dos días durante aproximadamente los próximos ocho días. Durante este tiempo, cada matriz de fibroblastos de colágeno debe contraerse de aproximadamente 3,5 centímetros a unos 1,5 centímetros de diámetro. Antes de comenzar el siguiente paso, esterilice todas las pinzas y equipos con etanol.Luego, utilizando pinzas estériles de punta roma, mueva suavemente una matriz contraída a un pocillo de una placa de 24 pocillos, asegurándose de que la matriz no se pliegue. A continuación, seleccione un matraz de células que se van a estudiar, separe las células con cuchillos para tripodes y peletee las células como antes, luego resuspenda las células en medio y agregue un mililitro de la suspensión celular encima de la matriz, y coloque la matriz contraída en el incubador hasta que las células hayan crecido hasta alcanzar casi la confluencia sobre la superficie de la matriz. Aproximadamente de tres a cinco días después de la autoclave, corte previamente rejillas de acero inoxidable para la creación de trípodes antes del uso; coloque una rejilla estéril en un recipiente plástico de seis centímetros y agregue suficiente medio de crecimiento para cubrir la rejilla.Crear la interfase aire-líquido es la parte más delicada de este procedimiento. La matriz debe colocarse sobre la rejilla y luego el medio debe aspirarse suavemente de manera que la matriz siga parcialmente sumergida desde la parte inferior y sea alimentada desde abajo. Esto crea un gradiente quimiotáctico y permite que las células en la parte superior comiencen a invadir la matriz.El comportamiento celular en este montaje puede evaluarse entonces durante 21 días o más. Coloque una matriz sobre la cuadrícula. A continuación, aspire suavemente el medio hasta que la parte inferior de la matriz esté en contacto con el medio, pero sin que este la cubra.La interfase aire-líquido debe parecerse entonces a la escena que se muestra aquí. A continuación, transfiera una matriz infiltrada sobre una superficie plana. Corte la matriz por la mitad con un escalpelo nuevo y luego levante la matriz con el escalpelo y transfiérala a PFA al 4%.Fije la matriz durante la noche a temperatura ambiente. En las siguientes dos figuras, se sembraron células de adenocarcinoma ductal pancreático o células P DAC sobre una matriz organotípica. En la primera figura, pueden observarse células P dac no invasivas en una capa sobre la matriz, mientras que en esta segunda figura se observan células P dac invasivas que han infiltrado la matriz. Aquí puede verse un equivalente de piel viva que muestra una epidermis estratificada sobre un componente dérmico contráctil de colágeno con fibroblastos. Pueden observarse células PD invasivas en verde interactuando con fibroblastos en rojo, que promueven la invasión de las células PDX en la matriz organotípica.Las células PD invasoras mostradas aquí nuevamente en verde se visualizan dentro de la matriz de colágeno, que se imagina mediante generación de segundo armónico y se muestra en morado; los sitios de degradación de la matriz son visibles como orificios oscuros dentro de la matriz morada. En esta figura se muestran células de melanoma C 8 1 61 invadiendo un equivalente dérmico contráctil de colágeno con fibroblastos, así como el análisis del comportamiento de procesos fundamentales de proteínas fluorescentes durante este ensayo. También puede utilizarse este ensayo junto con tinción inmunohistoquímica para examinar marcadores de proliferación celular y diferencias en la supervivencia celular, entre otros.

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