Inmunotinción de células encapsuladas en un sistema de hidrogel 3D

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga células de mamíferos encapsuladas en un sistema de hidrogel que imite el entorno natural de la matriz extracelular.

Retire el medio de cultivo. Tratar con un tampón de fijación para reticular las proteínas, preservando la integridad celular.

Agregue una solución que contenga detergente para permeabilizar la membrana celular.

Introducir una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos inespecíficos en los pasos posteriores.

Agregue un cóctel de anticuerpos primarios que ingrese a las células y se una específicamente a los filamentos intermedios citoplasmáticos y al factor de transcripción objetivo.

Retire los anticuerpos no unidos. Introduzca anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia y una tinción nuclear para marcar el ADN de forma fluorescente.

Retire las moléculas sueltas.

Monte el cultivo de hidrogel en un portaobjetos utilizando un medio de montaje.

Utilice un microscopio confocal para observar las células inmunoteñidas.

Primero, aspira el medio de cada pocillo. Luego, lave los pocillos con 1 mililitro de DPBS tibio. Una vez completado el lavado, agregue 750 microlitros de solución de fijación a cada pocillo. Luego, incube la placa de 24 pocillos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, aspire la solución de fijación de cada uno de los pocillos y deseche el fijador en un contenedor de desechos peligrosos. A continuación, agregue 1 mililitro de DPBS a la muestra e inmediatamente deseche el DPBS en un contenedor de desechos peligrosos.

A continuación, agregue 750 microlitros de solución de permeabilización para permeabilizar la muestra durante una hora a temperatura ambiente en el balancín, a 15 revoluciones por minuto. Después de una hora, aspire la solución de permeabilización y agregue 750 microlitros de solución de bloqueo a la muestra. Deje la muestra en el balancín a temperatura ambiente durante tres horas. Luego, diluya los anticuerpos primarios deseados con la solución de dilución de anticuerpos.

A continuación, agregue 500 microlitros de la solución de anticuerpos a cada muestra. Incubar las muestras durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, aspirar la solución de anticuerpos primarios. Luego, lave las muestras con PBST durante una hora tres veces, a temperatura ambiente, a 15 revoluciones por minuto.

A continuación, diluya los anticuerpos secundarios apropiados y 5 mg / ml de solución madre DAPI para lograr una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro. Luego, agregue 500 microlitros de la solución a cada muestra. A continuación, use papel de aluminio para cubrir la placa de 24 pocillos e incube la placa a 4 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave las muestras con PBST tres veces, cada una durante 30 minutos a temperatura ambiente en un balancín. A continuación, coloque una gota de medio de montaje rígido en la superficie de un portaobjetos de vidrio y coloque la muestra en el medio de montaje. Finalmente, use esmalte de uñas para sellar las muestras al portaobjetos de la cubierta de vidrio para evitar la contaminación o el movimiento de la muestra.