Evaluación de la distribución intracelular de conjugados de anticuerpos modificados con péptidos derivados de virus

Comience con células eritroblastas humanas adheridas.

Introducir conjugados de anticuerpos modificados con péptidos derivados del virus. Estos conjugados contienen una secuencia de localización nuclear, o NLS, del virus y un residuo de ácido cólico.

Durante la incubación, los conjugados de anticuerpos interactúan con los receptores de la superficie celular y se internalizan dentro de los endosomas.

El ácido cólico en el conjugado ayuda a escapar del compartimento endosómico, permitiendo la acumulación intracelular, mientras que las proteínas de transporte y NLS facilitan su localización nuclear.

Introduzca tripsina y tampón que contenga EDTA para separar las células y eliminar los conjugados unidos a la superficie.

Agregue medios enriquecidos con suero para inhibir la actividad de la tripsina.

Centrifugar para recoger las células; fijarlas y permeabilizarlas.

Introducir anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo rojo lejano, unirse a conjugados localizados y lavar.

Tratar con un tinte nuclear.

Observe bajo un microscopio confocal y capture imágenes a varias profundidades planas.

Después del procesamiento de imágenes, la célula muestra pequeños focos fluorescentes verdes dentro del citoplasma y el núcleo, lo que confirma la distribución intracelular de los conjugados de anticuerpos.

Trate las células diana TF-1a con 200 conjugados nanomolares de ácido cólico-anticuerpo 7G3. Incluir células tratadas con anticuerpos monoclonales de control modificados. Incube 5 x 10⁶ células positivas para antígenos con los conjugados a 37 grados centígrados durante una hora. Luego retire el sobrenadante y use un mililitro de PBS helado para lavar las células tres veces.

Agregue medio fresco e incube las células a 37 grados centígrados durante una hora más. A continuación, agregue 0,5 mililitros de PBS que contengan tripsina y EDTA al 0,25%, e incube las células a 37 grados centígrados durante un máximo de 30 minutos. Luego, use 1,5 mililitros de medio RPMI-1640 con 10% de FBS para neutralizar la tripsina.

Centrifugar las células a 500 veces g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y use 0,5 mililitros de PBS helado para lavar las células tres veces más. Agregue 0,5 mililitros de PFA al 1% y sacarosa al 1% en PBS a las células y colóquelas en hielo durante 30 minutos para fijarlas.

Luego use 0,5 mililitros de PBS helado para lavar las celdas tres veces y centrifugar las muestras a 250 veces g durante cinco minutos. A continuación, agregue Triton X-100 al 0,15% en PBS a las células y permeabilice en hielo durante cinco minutos. Luego, con PBS helado, lave las celdas y repita la centrifugación.

Suspender las células en 0,1 mililitros de PBS que contengan dos microgramos por mililitro de un anticuerpo policlonal secundario Fc antimurino conjugado con AlexaFluor 647, e incubar las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar las células a 250 veces g durante cinco minutos y utilizar 0,5 mililitros de PBS helado para lavar las células tres veces.

Luego vuelva a suspender las células en 0,5 mililitros de PBS. Agregue 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio a las células. Luego, use un medio de montaje para montar 1 x 10^{5 celdas} en portaobjetos de vidrio antes de cubrir la muestra con un cubreobjetos de vidrio. Examine las células con un objetivo de inmersión en aceite Plan Apo 60X, apertura numérica 1.42, en un microscopio confocal de barrido láser invertido.

Detecte la fluorescencia PI utilizando el láser de argón de 488 nanómetros y el prisma de barrido espectral configurado para 600 a 650 nanómetros. Para la fluorescencia AF 647, utilice el láser de helio-neón de 633 nanómetros y el prisma de barrido espectral de 650 a 700 nanómetros. Recopile imágenes de P1 y AF 647 secuencialmente, de 1024 por 1024 píxeles con un promedio de línea 2X tomado a intervalos de 0,5 micras a través de todo el grosor de la celda. Presente imágenes como proyecciones Z.

Para analizar las células, evaluar y registrar si la fluorescencia intracelular en el citoplasma está agrupada y cerca de la superficie celular o difusa y homogénea. Además, evalúe la intensidad relativa de fluorescencia por celda.