Evaluación de la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T mediante un tinte indicador de calcio

Comience con una suspensión de células T de ratón e introduzca un colorante indicador de calcio: Indo-1-acetoximetiléster.

El colorante ingresa a las células, donde las esterasas intracelulares escinden el grupo acetoximetilo para formar Indo-1 impermeable a la membrana, que exhibe una fluorescencia distinta en formas libres de calcio y unidas al calcio.

Agregue anticuerpos contra el receptor Fc para bloquear sitios de interacción inespecíficos.

Introducir anticuerpos marcados con fluoróforo para teñir subconjuntos de células T.

Elimine los anticuerpos no unidos y tiña con un colorante de viabilidad que tiñe diferencialmente las células vivas y muertas.

En citometría de flujo, detecte inicialmente la fluorescencia tenue de las células vivas e identifique las células T marcadas con fluoróforos, seguido de la medición de la fluorescencia Indo-1 dentro de estas células.

Tratar con anticuerpos anti-CD3, que interactúan con el complejo CD3 del receptor de células T y activan las vías de señalización de las células T, induciendo la entrada de calcio en el citosol.

El tinte indo-1 interactúa con los iones de calcio liberados, cambiando la fluorescencia del tinte de azul a violeta.

El cambio en la fluorescencia Indo-1 de estados libres de calcio a estados unidos al calcio confirma la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T.

Para comenzar, prepare una solución madre de 1 microgramo por microlitro de Indo-1 AM agregando 50 microlitros de DMSO en un vial, que contenga 50 microgramos de Indo-1 AM. Diluya la solución madre en un volumen apropiado de cRPMI a una concentración de 6 microgramos por mililitro.

Coloque el medio en un baño de agua a 37 grados centígrados. Luego, use este medio para diluir una suspensión celular previamente preparada en una proporción de 1 a 1 para obtener de 5 a 6 millones de células por mililitro. A continuación, a una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos, agregue 1 mililitro de suspensión celular por pocillo, según la condición experimental.

Prepare una muestra de control de tinción única para Indo-1 AM sin calcio agregando EGTA a células cargadas con colorante Indo-1. Repare un pozo para el control biológico negativo sin fluoróforos ni colorante Indo-1. Prepare un control positivo de Indo-1 agregando ionomicina a una concentración de 50 micromoles a la suspensión celular cargada de colorante en el citómetro de flujo.

Además, prepare un pocillo para controles de tinción única para poblaciones celulares adicionales, utilizando fluoróforos conjugados con anticuerpos. Luego agregue 2 microgramos de anticuerpo bloqueador del receptor FC por millón de células e incube la placa durante 45 minutos, con golpecitos cada 15 minutos para resuspender las células.

Después de la incubación, mezcle y retire todo el volumen de células de la placa y agréguelo a tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Centrifugar y decantar el sobrenadante. Una vez que las células se lavan con 1 mililitro de cRPMI precalentado, vuelva a granular y decante el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células en 1 mililitro de cRPMI e incube cada tubo, dejando la parte superior del tubo ligeramente abierta para el intercambio de gases, lo que permite la desesterificación completa de los ésteres AM intracelulares. A continuación, prepare una mezcla maestra de todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo definidos por el usuario y agréguela a las células en reposo durante 1 mililitro del volumen celular.

Después del descanso, peletice las celdas y lave el gránulo resuspendiéndolo en 1 mililitro de cRPMI enfriado a 4 grados centígrados. Repita este paso y coloque los tubos en hielo. Vuelva a suspender muestras individuales en 500 microlitros de cRPMI sin rojo de fenol, utilizando un tubo de flujo de poliestireno de 5 mililitros con tapa.

Para mantener la temperatura mediante el análisis de flujo de calcio, prepare un baño de perlas agregando perlas de baño a un pequeño baño de agua y caliéntelo a 37 grados centígrados. Corta con cuidado un tubo cónico de 50 mililitros por la mitad y desecha la parte superior del tubo. Llene 3/4 del tubo restante con perlas de baño y deje que alcance los 37 grados centígrados en el baño de perlas.

Coloque el baño de perlas cerca de un citómetro de flujo, junto con una rejilla de espuma de poliestireno para colocar el tubo. Antes del análisis en el citómetro de flujo, caliente los tubos individualmente a 37 grados centígrados durante siete minutos. Inicie sesión en el software del citómetro de flujo y haga clic en la pestaña Biblioteca.

Luego, seleccione etiquetas fluorescentes para agregar Indo-1 unido al calcio e Indo-1 libre de calcio. Luego, seleccione láser UV en grupos de etiquetas fluorescentes y haga clic en Agregar más para agregar un nombre de etiqueta fluorescente. Elija la longitud de onda de emisión y excitación del láser y, a continuación, haga clic en Guardar.

Continúe con la configuración experimental. haga clic en la pestaña Adquisición. Abra o cree un nuevo experimento y agregue las etiquetas fluorescentes deseadas al experimento. Cree un grupo de referencia y un nuevo grupo de muestra para el experimento y etiquete ambos grupos.

En la pestaña Adquisiciones, establezca los eventos que se registrarán al máximo en 10 millones, el volumen de detención en el volumen máximo de 3.000 microlitros y el tiempo de detención en el máximo de 36.000 segundos. Adquiera controles de tinción única para anticuerpos conjugados definidos por el usuario, incluidos en el panel multicolor, y para colorante funcional Indo-1.

Agregue 50 micromoles de ionomicina al control positivo Indo-1 unido al calcio y al vórtice. Agregue el tubo de flujo a la placa de inyección de muestras y haga clic en Grabar. Luego, agregue el control negativo Indo-1 libre de calcio al citómetro de flujo y haga clic en Grabar.

Desmezcle los controles de una sola mancha haciendo clic en el botón Desmezclar. Una vez que se complete la desmezcla, cree gráficos secuenciales utilizando la hoja de trabajo sin mezclar, como SSCA versus FSCA para eliminar los desechos de la muestra y SSCA versus SSCH para eliminar dobletes.

Luego cree puertas haciendo clic en Trazar. Agregue un trazado a la hoja de cálculo y haga doble clic dentro de la puerta para crear una población cerrada aguas abajo. Continúe hasta que se contabilicen todas las poblaciones de interés. A continuación, caliente las muestras de control de tinción única previamente preparadas a 37 grados Celsius para su análisis secuencial.

Configure el software de citometría de flujo y haga funcionar agua desionizada durante 2 a 3 minutos para garantizar la estabilidad fluídica del citómetro de flujo. Configure trazados secuenciales en la hoja de trabajo sin mezclar creando puertas utilizando los botones de puerta de polígono, rectángulo o elipse para incluir la población de interés.

Haga doble clic dentro de la puerta y cambie los parámetros de los ejes Y y X a SSCA en lugar de SSCH. Complete la definición de los parámetros del eje haciendo clic con el botón izquierdo en el eje. Cree un gráfico con SSCA versus señal de colorante de viabilidad. Elimine las células vivas, que son negativas o tinte con colorante de amina.

Las células vivas negativas para la tinción de células vivas muertas se agruparán en la marca cero en los ejes y y x. Haga doble clic en el gráfico interior para crear un nuevo gráfico, que contenga solo linfocitos vivos unicelulares. Cambie el eje y a uno en función del tiempo en el eje x para visualizar la entrada de calcio.

A continuación, coloque la muestra biológica calentada en el SIT de la máquina. Ejecute las muestras a 2.500 a 3.000 eventos por segundo en un caudal medio para visualizar la entrada de calcio en un número limitado de poblaciones celulares. Agregue el siguiente tubo al baño de cuentas.

En Control de adquisición, presione Grabar para registrar los datos iniciales durante 30 segundos para obtener un nivel basal de señalización de calcio en la muestra. Luego haga clic en Detener y retire el tubo del puerto de inyección de muestra. Agregue 30 microgramos de anti-CD3 no conjugado directamente en el tubo de muestra para iniciar la entrada de calcio.

Vuelva a colocar rápidamente el tubo en el puerto de inyección de muestras y presione Grabar en el software. Registre datos durante siete minutos, observando el tiempo transcurrido bajo los controles de adquisición en el software. Luego presione Detener en el software.