Evaluación de la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T mediante un tinte indicador de calcio
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 8:14 min. • July 8th, 2025
Comience con una suspensión de células T de ratón e introduzca un colorante indicador de calcio: Indo-1-acetoximetiléster.
El colorante ingresa a las células, donde las esterasas intracelulares escinden el grupo acetoximetilo para formar Indo-1 impermeable a la membrana, que exhibe una fluorescencia distinta en formas libres de calcio y unidas al calcio.
Agregue anticuerpos contra el receptor Fc para bloquear sitios de interacción inespecíficos.
Introducir anticuerpos marcados con fluoróforo para teñir subconjuntos de células T.
Elimine los anticuerpos no unidos y tiña con un colorante de viabilidad que tiñe diferencialmente las células vivas y muertas.
En citometría de flujo, detecte inicialmente la fluorescencia tenue de las células vivas e identifique las células T marcadas con fluoróforos, seguido de la medición de la fluorescencia Indo-1 dentro de estas células.
Tratar con anticuerpos anti-CD3, que interactúan con el complejo CD3 del receptor de células T y activan las vías de señalización de las células T, induciendo la entrada de calcio en el citosol.
El tinte indo-1 interactúa con los iones de calcio liberados, cambiando la fluorescencia del tinte de azul a violeta.
El camb
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